[發明專利]一種編輯POMK基因的系統及其用途

在審

• 申請號: 202011416237.X
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN114591951A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 趙恩峰;劉啟慧;黃童;王延賓;賀小宏;任江濤;韓露
• 申請（專利權）人: 江蘇浦珠生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;C12N15/85
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

本發明涉及POMK基因的編輯，尤其是篩選到針對POMK的敲除效率較高的sgRNA序列，其包含的間隔子序列如SEQ ID NO：16所示。

技術領域

本發明屬于基因工程和基因遺傳修飾技術領域，涉及基于CRISPR/Cas9技術的POMK基因的編輯及其用途。

背景技術

POMK也稱為蛋白O-甘露糖激酶，其在腦、睪丸及其他25個組織中均有表達。

(protein O-mannose kinase):O-mannose蛋白激酶。該基因編碼一種蛋白，該蛋白可能參與-dystroglycan(a-dg)的laminin結合O型碳水化合物鏈的呈現，在細胞外基質和外骨骼之間形成跨膜連接。一種具有磷酸化修飾功能的分泌性蛋白；雖然與Ser/Thr蛋白激酶家族有關，但沒有蛋白激酶活性，而是作為甘露糖激酶。據報道，POMK能在內質網管腔內使α-Dystroglycan糖蛋白上的甘露糖殘基磷酸化，進而調控其后續糖鏈延伸。POMK的病變會引起α-Dystroglycan的功能異常，影響肌肉和腦的發育，造成先天性肌肉營養不良癥。

發明內容

目前，CRISPR技術作為一種新的基因組工程化工具，由于其操作簡單，靶向精確，已被廣泛應用于細胞的基因組編輯和免疫療法的開發中。最常用的包括II型、V型、VI型等CRISPR系統。以II型CRISPR系統為例，在外源DNA入侵時，來自CRISPR重復陣列的轉錄物被Cas9和RNase III核酸酶加工為成熟的crRNA，隨后與tracrRNA和Cas9組成復合體。通過識別PAM，crRNA將該復合體引導至靶標DNA，并通過crRNA包含的間隔區序列與靶DNA的結合，解開DNA雙鏈，再由Cas9中的HNH結構域剪切crRNA的互補DNA鏈，RuvC結構域剪切非互補鏈，最終在靶標DNA處引入雙鏈斷裂。人們還發現，引導Cas9結合并切割特定的DNA序列不需要RNA復合物。通過使用設計的嵌合單向導RNA(sgRNA)可以簡單地實現該過程。

術語“單向導RNA”或“sgRNA”是指通過將crRNA和tracrRNA分子融合成“單個向導RNA”的人工工程化RNA，當與Cas9蛋白結合時，其能夠識別并切割向導RNA特異性的DNA靶標。sgRNA一般包含間隔子序列(spacer)和骨架序列，這兩個序列可以在同一個分子中或不同的分子中。間隔子序列的作用是指導Cas9蛋白切割與間隔子序列互補的DNA位點，也即靶序列。一般而言，間隔子序列是與靶序列具有足夠互補性以便與該靶序列雜交、并且指導CRISPR復合物與該靶序列特異性結合的任何多核苷酸序列。間隔子序列與其相應的靶序列之間的互補程度是約或多于約50％或更多。一般間隔子序列的長度為約20個核苷酸。骨架序列為sgRNA中必須的，除間隔子序列之外的其余序列，一般包含tracr序列和tracr配對序列，這些序列一般不會因為靶序列的變化而改變。由于骨架序列不影響sgRNA對靶序列的識別，因此，骨架序列可以是現有技術中任何可行的序列。骨架序列的結構可參見如文獻Nowak et al.Nucleic AcidsResearch 2016.44:9555-9564。

在本文中可采用的骨架序列如下表1所示。

表1.示例性的sgRNA骨架序列

sgRNA，尤其是其中間隔子序列的設計需要考慮很多因素，例如長度、堿基組成、靶基因的結合位置、與非靶標位點的結合率、是否包含SNP、二級結構等等。目前已經可以通過各種在線工具來設計sgRNA。然而，由于Cas酶可以切割任何鄰近PAM位點的靶序列，針對特定的靶基因而言，在線工具設計的大量sgRNA的編輯效率都不盡相同，甚至差異很大，例如，PAM位點是5'-NGG-3'的編輯效率通常就比5'-NGA-3'或5'-NAG-3'的高。因此，篩選特異性高的sgRNA對于CRISPR系統編輯效率的提高至關重要。