[發明專利]檢測人SEPT9基因甲基化的試劑盒及其使用方法、應用

在審

• 申請號: 202011414930.3
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112322743A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 王志強;萬季;蔡雪兒;羅海燕;王一杏;夏迪;汪健;金泰慶;關建洪;王弈;宋麒
• 申請（專利權）人: 深圳市新合生物醫療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京冠和權律師事務所 11399
• 代理人: 田春龍

本發明公開了一種檢測人SEPT9基因甲基化的試劑盒及其使用方法、應用。該試劑盒包括檢測或測量受試樣品DNA中SEPT9基因的甲基化狀態或水平的特異性引物和探針。本發明試劑盒能夠顯著提高早期肝癌的陽性檢出率和特異性(真實陰性率)，可將生物標記物的檢測靈敏度提高到皮克/納克級DNA分子，檢測靈敏度的提高是通過優化特定核苷酸序列引物及DNA探針以及改進血漿游離DNA的亞硫酸氫鹽處理方法來實現的。

技術領域

本發明屬于生物技術和DNA檢測技術領域，尤其涉及一種用于肝癌檢測的DNA甲基化 qPCR試劑盒及其使用方法，具體而言，涉及一種利用血漿游離DNA進行甲基化qPCR以確定一個或多個目標基因靶點(例如SEPT9)的甲基化狀態來用于肝癌檢測或篩查的試劑盒及其使用方法。

背景技術

原發性肝癌以肝細胞癌為主。在全球范圍內，肝癌是癌癥相關死亡的第四大原因，在患者發病率方面排名第六位。其發病隱匿,無特異性臨床表現,往往發現時已進展到晚期,錯過了最好的治療時機,因此預后較差。肝癌發現越早，治愈的可能性越大，但是早期肝癌一般無癥狀，無體征，不易被發現。臨床上對于肝癌高危人群的診斷和隨訪主要依賴影像學和腫瘤標記物AFP的檢測。然而，影像學(B超、CT、MRI等)和CEA，AFP等血清標記物的檢測在早期肝癌的診斷上存在一定的局限性，前者設備成本高，操作技術要求強并且檢測成本高；后者由于其靈敏度和特異度較低，仍然無法充分滿足臨床檢測需要。此外，作為肝癌診斷金標準的組織活檢的侵入性強，不適于早癌的篩查。并且這樣的創傷性檢測方式，給患者帶來了非常大的生理病痛，因此患者不易接受。因此，在肝癌的早期診斷方面急需更精確更個性化的手段。

液體活檢是用檢測分子生物標志物來替代傳統組織活檢的非侵入性方法，其用于分析的生物樣品(如DNA)可以從血液、尿液、唾液、痰液或組織樣本中獲得。與傳統的癌癥診斷方法相比，液體活檢具有以下優勢：

1.易取得，液體活檢樣本可從尿液、唾液和胸腔積液中獲得；

2.比傳統的腫瘤活組織檢查更少侵入性；

3.能取樣所有可能的癌細胞，而非僅局限于腫瘤活檢的某部分；

4.便于早期發現癌癥；

5.能用于監測腫瘤動態(治療前、治療間和治療后)；

6.具有能作為理想識別標靶治療因子的潛力。

壞死或凋亡的細胞釋放到血液中的DNA，被稱為循環游離DNA(circulating freeDNA， cfDNA)，然而在腫瘤患者的血液中，一部分cfDNA來自死亡的腫瘤細胞，這部分DNA就被定義為循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA蛋白質復合物或游離DNA兩種形式存在，這些ctDNA 多為大約134-144bp的DNA片段，并攜帶一定的腫瘤特征(包括異常甲基化、突變、缺少、插入、拷貝數等)。較早期的癌癥(意味著腫瘤尺寸較小且癌細胞較少)，釋放較少的游離循環腫瘤ctDNA，而其濃度更小于游離cfDNA；當腫瘤負荷增加時，患者的ctDNA水平會升高。迄今為止，ctDNA是獲得癌癥患者血液中分子腫瘤相關改變的診斷、預后、以及預測信息的最佳材料。

DNA甲基化改變是癌癥進程中最早發生的分子變化之一，且具有組織特異性，腫瘤抑制基因的高甲基化水平已被確定為抑制基因表達和促進癌前病變組織轉化為惡性腫瘤細胞的重要分子機制。其中，SEPT9基因，即人類Septin9基因，位于染色體17q25的AC068594內，為S印tin基因家族的成員，與膜泡運輸到胞質分裂的多種細胞功能相關。研究表明肝硬化患者ctDNA中SEPT9基因啟動子區域甲基化與否，診斷患者是否已從肝硬化發展為肝癌，SEPT9 可以作為一個有效的表觀遺傳學的標志物，作為肝細胞癌的個性化診斷標簽。因此，對SEPT9 基因的甲基化狀態進行分析可用于診斷肝癌的狀態。