[發明專利]嗜熱幾丁質酶Chi304突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011414747.3
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112195168B
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 關菲菲;伍寧豐;田健;劉曉青;張巖;田曉倩
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了嗜熱幾丁質酶Chi304突變體及其制備方法和應用。本發明通過基因共識設計氨基酸序列為SEQ ID No.1所示的幾丁質酶Chi304的系列單點突變體，最終成功篩選得到酶活和熱穩定性提高的單點突變體Y166F以及表達量、最適溫度、熱穩定性和底物結合能力均提高的單點突變體D421E。此外，Y166F和D421E這兩個單點突變體對底物的轉化能力較野生型也有了明顯的提高。本發明為工業上幾丁質的高溫酶法降解奠定了理論基礎，并為幾丁質酶的工業化應用創造了條件。

技術領域

本發明涉及幾丁質酶突變體，尤其涉及嗜熱幾丁質酶Chi304的單點突變體，本發明還涉及嗜熱幾丁質酶Chi304突變體的制備方法以及該突變體在降解幾丁質中的應用，屬于幾丁質酶突變體及應用領域。

背景技術

幾丁質又名甲殼質、甲殼素，是一種由N-乙酰葡糖胺通過β-1,4糖苷鍵聚合而成的天然高分子多糖，自然條件下為白色或灰白色無定型固體，分子量通常在30-3000kDa，乙酰度在90%以上，廣泛分布在海產品蝦蟹外殼、真菌和藻類細胞壁中，是海洋微生物生長繁殖中最重要的可再生氮源和碳源，在自然界中的含量僅次于纖維素占第二位。

伴隨人工養殖海產品技術的發展，蝦蟹殼等餐桌廢棄物大量堆積造成全球范圍污染加劇，加工過程中所產生廢棄物可占其原料的50%，其中近30%為幾丁質。僅海洋無脊椎動物每年產生的幾丁質就高達1.6億噸。幾丁質的降解產物如幾丁寡糖和殼寡糖等，由于其安全無毒的特質，在生物醫藥、農業、食品、化妝品等行業應用廣泛，具有良好的經濟效益和開發前景。目前幾丁質降解的主要方法為濃酸斷裂多糖糖苷鍵的化學降解法，該方法在處理過程中除了存在環境污染和產物不可控的缺點外，其高生產成本和加工能耗也為企業造成較大負擔。而酶法降解作為目前眾多幾丁質降解方法中最高效、環保的方法，不僅具有使用成本低、綠色安全等優點，其產物的高純度還簡化了后續純化處理步驟。

幾丁質酶作為一類糖苷水解酶，能夠有效水解幾丁質中β-1,4糖苷鍵，生成高價值的幾丁寡糖。幾丁質酶廣泛存在于細菌、真菌、病毒和動植物體內。幾丁質高致密的晶體結構導致其降解困難，生產加工通常在高溫條件下進行，以達到幾丁質解構的效果，因此高溫幾丁質酶在實際生產中具有不可替代的作用。目前已知的幾丁質酶大多利用傳統的方法從可培養的微生物中分離得到，由于微生物的生長條件限制，所分離到的酶熱穩定性差、酶活力和表達量偏低，達不到工業化應用的要求。

因此，高效篩選得到嗜熱且高效的幾丁質酶并通過理性設計等手段提升它的酶學性能，將具有極高的產業應用價值。

發明內容

本發明的目的之一將是提供一種嗜熱幾丁質酶Chi304突變體；

本發明的目的之二將是將所述嗜熱幾丁質酶Chi304突變體及其編碼基因等應用于降解幾丁質；

為實現上述目的，本發明所采取的技術方案包括：

作為本發明一種具體的實施方式，本發明提供了一種嗜熱幾丁質酶Chi304突變體，該突變體通過將SEQ ID No.1所示的氨基酸序列進行Y71K、L133T、F135I、Y166F、Y172F、W181Y、A220E、G262N、F396Y或D421E中的任何一種氨基酸單位點突變所獲得的突變體；優選的，將SEQ ID No.1所示的氨基酸序列進行L133T、Y166F、Y172F、A220E或D421E中的任何一種氨基酸單位點突變所獲得的突變體；更優選的，將SEQ ID No.1所示的氨基酸序列進行Y166F或D421E氨基酸單位點突變所獲得的突變體。

本發明所述氨基酸單位點突變“Y71K”表示將氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示的嗜熱幾丁質酶Chi304的第71位氨基酸由酪氨酸（Y）突變成賴氨酸（K）；其余的單位點突變的表述依此類推。

所述的嗜熱幾丁質酶Chi304突變體的編碼基因也屬于本發明的保護范疇之內。