[發明專利]來源于貝萊斯芽孢桿菌質粒的復制元件及其應用

有效

• 申請號: 202011414501.6
• 申請日: 2020-12-07
• 公開（公告）號: CN112195190B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 劉波;盧志軍;張偉;徐欣欣;張宇宏;田輝
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/75;C12R1/125;C12R1/10;C12R1/07
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍;霍雪梅

本發明公開了來源于貝萊斯芽孢桿菌質粒的復制元件及其應用。本發明首先提供了從貝萊斯菌株內生性質粒中分離鑒定質粒的復制元件，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。本發明進一步將從貝萊斯菌株內生性質粒中分離鑒定質粒的復制元件應用于構建芽孢桿菌表達系統，將外源基因在芽孢桿菌中進行高效表達；進一步的，本發明提供了一種芽孢桿菌表達載體，包括啟動子、在芽孢桿菌中進行自主復制的復制元件、在大腸桿菌中進行自主復制的復制元件以及在芽孢桿菌中表達的外源基因。應用本發明提供的復制元件能夠介導外源基因在芽孢桿菌中高拷貝復制并高強度表達。

技術領域

本發明涉及構建芽孢桿菌高效表達系統的元件，尤其涉及來源于貝萊斯芽孢桿菌內生性質粒的用于構建芽孢桿菌高效表達系統的復制元件，屬于芽孢桿菌表達系統的復制元件及其應用領域。

背景技術

芽孢桿菌屬細菌因可形成抗逆性極強的內生孢子而在自然界中廣泛分布，其中，桿菌枯草芽抱桿菌作為GARS（Generally Recognized as Safe）菌種之一，被廣泛應用于食品、飼料等多個領域，有著巨大的經濟、社會效益和生態效益（張慧等人，2019，熱帶植物學報，40：995–1001）。同時，枯草芽孢桿菌作為一個優良細胞工廠，能高效生產應用領域較廣的酶蛋白（如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶）（余曉霞等人，2015，生物技術通報，31：35–44），以枯草芽孢桿菌為宿主的蛋白表達系統是目前應用最廣泛的表達系統之一。在枯草芽孢桿菌乃至芽孢桿菌的表達系統優化主要集中于高強度啟動子挖掘和分泌信號肽篩選，諸多性能優異的啟動子如P₄₃、P_sacB、P_xyl等相繼被挖掘（余曉霞等人，2015，生物技術通報，31：35–44）。相對于啟動子的多樣性而言，用于構建芽孢桿菌表達載體的復制元件較為匱乏。研究表明，大部分枯草芽孢桿菌不含有內源性質粒，目前枯草芽孢桿菌表達系統的表達載體主要由葡萄球菌和鏈球菌內源性質粒（包括pUB110、pC194、pE194和 pT181）改造而來（Yang等人，2006，Biotechnology Letters，28：1713–1718；Kunst等人，1997，Nature，390：249–256），因此，深入挖掘可在芽孢桿菌中行使復制功能的元件有著重要現實需求和應用前景。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）為厚壁菌門、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，是一類產芽孢的革蘭氏陽性細菌，具有抗菌譜廣、生長迅速、易分離培養、抗逆性強和生物安全性高等優點，在眾多行業中被廣泛應用。貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌親緣性很高，貝萊斯芽孢桿菌來源的質粒及其復制元件在枯草芽孢桿菌中往往具有生物學功能。據報道，80%貝萊斯菌株中不含有內生性質粒（Grady等人，2019，BMC Microbiology，19：5）。因此，如果能夠從貝萊斯菌株中發現內生性質粒并一步分離鑒定質粒復制的元件對于構建貝萊斯芽孢桿菌乃至芽孢桿菌高效表達系統均具有重要意義。

發明內容

本發明的目的之一是從貝萊斯菌株中發現內生性質粒并一步分離鑒定質粒的復制元件；

本發明的目的之二是將從貝萊斯菌株中分離鑒定的質粒復制元件應用于芽孢桿菌表達載體的復制元件。

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：

本發明首先提供了從貝萊斯菌株內生性質粒中分離鑒定質粒的復制元件，其核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示。