[發明專利]一種檢測細胞內源性低豐度基因和lncRNA水平的方法

在審

• 申請號: 202011409199.5
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN114591949A
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發明（設計）人: 楊輝;周海波;高妮
• 申請（專利權）人: 中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/22;G01N21/64
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 張璐;徐迅

1.一種sgRNA響應型啟動子，其特征在于，所述啟動子能夠響應于上游的由內源轉錄本控制表達的sgRNA、dCas9和轉錄激活因子所形成的復合物，并啟動下游報告基因的表達。

2.如權利要求1所述的sgRNA響應型啟動子，其特征在于，所述的sgRNA響應型啟動子是miniCMV啟動子。

3.一種細胞內源核酸的檢測體系，其特征在于，包括：

(a)目標核酸編輯模塊，包括：靶向報告系統目標核酸的sgRNA、tRNA；

其中，所述的目標核酸編輯模塊中包括如式I所示的結構，

L₁-(tRNA-sgRNA)_n-tRNA-R₁ (式I)

式中，

L₁是5’端的同源臂；

R₁是3’端的同源臂；

tRNA是能成功釋放出有功能的sgRNA內源機制；

sgRNA是向導RNA；

n是≥1的正整數，優選地2≤n≤10；和

(b)目標核酸報告模塊，包括：一報告核酸構建物、dCas蛋白、轉錄激活因子；

其中，所述的報告核酸構建物具有如式II所示的結構，

(TS-I)_m-TS-P₁-Z₂ (式II)

式中，

TS是所述sgRNA的結合靶位點；

m是≥0的正整數，優選地2≤m≤4；

I是TS之間的間隔序列；

P₁是如權利要求1所述的sgRNA響應型啟動子；

Z₂是報告基因序列。

4.如權利要求3所述的檢測體系，其特征在于，所述細胞內源核酸包括細胞內源基因或長非編碼RNA(lncRNA)。

5.如權利要求3所述的檢測體系，其特征在于，所述的細胞內源低豐度基因是指當以Gapdh內參基因做相對定量時，在細胞內表達量0.001的基因。

6.如權利要求3所述的檢測體系，其特征在于，所述(a)中的sgRNA靶向于所述目標核酸的3’端未翻譯區域(3’UTR)。

7.一種用于檢測細胞內源核酸的試劑盒，其特征在于，包括如權利要求3所述的檢測體系。

8.一種檢測細胞樣本中是否存在目標內源核酸的方法，其特征在于，包括步驟：

(i)將權利要求3所述的檢測體系引入待檢測細胞樣本中；和

(ii)檢測所述檢測體系中的檢測目標核酸報告模塊中的報告基因或其編碼產物的水平。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括動態檢測細胞樣本中的目標內源核酸的水平。

10.如權利要求1所述的sgRNA響應型啟動子或如權利要求3所述的檢測體系的用途，其特征在于，用于制備一試劑盒，所述的試劑盒用于檢測細胞內源核酸。