[發明專利]一種制備串聯重復蛋白質的方法與應用

在審

• 申請號: 202011405477.X
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN113755512A
• 公開（公告）日: 2021-12-07
• 發明（設計）人: 畢昌昊;張學禮;劉麗;趙東東;李斯微
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/12;C12N1/21;C07K14/435;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 莫舒穎

本發明提供一種制備串聯重復蛋白的方法及其相關產品與應用。本發明制備串聯重復蛋白的方法包括將含有名稱為單拷貝基因表達盒的雙鏈DNA分子的表達載體導入受體細胞得到重組細胞，提取所述重組細胞的總RNA，翻譯所述總RNA得到串聯重復蛋白，極大縮減制備長串聯重復蛋白的時間。實驗證明僅需7天便可獲得重復40次的串聯重復MaSp1，比傳統方法大幅度縮短了的時間。本發明的方法具有實驗周期短、節省時間和成本、效率高等特點。

技術領域

本發明涉及生物技術領域中一種制備串聯重復蛋白質的方法與應用。

背景技術

串聯重復蛋白是氨基酸序列高度重復的蛋白，由串聯重復基因表達產生。以往制備串聯重復蛋白是通過構建含有串聯重復DNA的表達載體，然后表達出串聯重復蛋白。目前串聯重復DNA表達載體構建采用的方法主要有非對稱粘性末端互補法和同尾酶法2種。非對稱粘性末端互補法生成的拷貝數較隨機，且需要多種酶進行酶切連接。同尾酶法也比較繁瑣，需要反復進行酶切連接。兩種方法皆費時費力。

蛛絲中的牽引絲蛋白具有很高的強度，在相同重量下，蛛絲的牽引絲強度是鋼絲的5倍，人造Kevlar纖維的3倍。同時，蛛絲還有良好的可塑性，這兩種特性使其廣泛應用的多種領域。在工業領域，例如制備降落傘，防護服，飛行器的復合材料。在生物醫藥領域，包括傷口縫合線，生物藥的運輸載體，細胞培養和器官移植的支架。牽引絲主要由蛛絲蛋白MaSp1(major ampullate spidroins 1)和MaSp2(major ampullate spidroins 2)組成。這兩種蛋白是高度模塊化的蛋白，序列內部有很長的重復序列，兩側序列長度大概有100氨基酸殘基。然而，蛛絲很難通過飼養蜘蛛大量獲取，因其具有強的領域意識和攻擊性。因此，很多研究嘗試在其他宿主中表達重組蛛絲蛋白。增加重組牽引絲蛋白的長度是提高蛛絲紡絲機械性能的關鍵因素之一。自然界中牽引絲蛋白大小為250–320kDa。一位學者在2010年則利用表達大腸桿菌表達出284.9kDa的重組蛛絲蛋白，且紡絲機械性能與天然蛛絲相似。表達184.9kDa的重組蛛絲蛋白需要先合成一個重復單元MaSp1，再利用同尾酶無縫拼接技術MaSp2串聯體，進而重復相同的方法依次合成MaSp4，MaSp8，MaSp16，MaSp32，MaSp48，最終拼成MaSp96。步驟繁瑣，費時費力。且如果想要優化蛛絲序列則需要重新合成基因，又需花費大量時間重新構建一系列串聯體。

發明內容

本發明要解決的問題是如何制備串聯重復蛋白質。

為了解決以上技術問題，本發明提供了一種制備串聯重復蛋白質的方法，包括將含有名稱為單拷貝基因表達盒的雙鏈DNA分子的表達載體導入受體細胞得到重組細胞，培養所述重組細胞，表達得到串聯重復蛋白質；所述單拷貝基因表達盒含有啟動子，與所述啟動子相連的名稱為3’內含子的內含子，與所述3’內含子相連的名稱為單拷貝基因的目的蛋白編碼基因，與所述目的蛋白編碼基因相連的核糖體結合位點(RBS)的編碼序列，與所述核糖體結合位點的編碼序列相連的間隔序列(Interval sequence)，與所述間隔序列相連的起始密碼子，與所述起始密碼子相連的名稱為5’內含子的內含子；所述3’內含子和所述5’內含子滿足條件A，所述條件A為在所述重組細胞中所述單拷貝基因表達盒轉錄出的前體RNA通過堿基互補配對形成剪接泡，并通過剪接反應產生成熟的環狀單鏈RNA分子；所述目的蛋白編碼基因不含終止密碼子。

上述方法中，所述間隔序列是RBS和ATG之間的一段序列，作用是使核糖體高強度地結合到mRNA上。所述間隔序列可為4-10bp的雙鏈DNA，如一條鏈的核苷酸序列是序列1的第5535-5543位核苷酸的雙鏈DNA。

上述方法中，所述串聯重復蛋白可含有2個以上的所述單拷貝蛋白，如7個拷貝以上的所述單拷貝蛋白，10個拷貝以上的所述單拷貝蛋白。

上述方法中，所述單拷貝基因表達盒由啟動子，所述3’內含子、所述目的蛋白編碼基因、所述核糖體結合位點的編碼序列、所述間隔序列、所述起始密碼子和所述5’內含子連接而成。