[發明專利]一種外泌體內多種miRNA特異性檢測方法

在審

• 申請號: 202011404585.5
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112680504A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 李喆;廖禮兵;于涵洋
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發明公開了一種外泌體內多種miRNA特異性檢測方法，包括如下步驟：構建非天然核酸框架探針結構；將所述非天然核酸框架探針結構與外泌體樣品共孵育，通過熒光分析檢測多種miRNA。該結構可以實現對外泌體內多種miRNA的特異性檢測：將非天然核酸框架探針與外泌體共孵育，前者進入外泌體后可對多種miRNA進行檢測。在無目標miRNA的環境中，納米夾子保持關閉，無熒光信號；當檢測到目標miRNA時，夾子打開并產生熒光信號。本方法可以有效地原位檢測外泌體內miRNA，避免對外泌體結構的破壞；可以同時檢測多種miRNA，提高檢測的效率；并具有抗酶降解等特性，可應用于臨床外泌體診斷。

技術領域

本發明涉及一種多種miRNA特異性檢測方法，尤其涉及一種外泌體內多種miRNA特異性檢測方法。

背景技術

外泌體(exosomes)是大小在30至150nm之間的納米級脂質囊泡，在細胞分泌后包含特定的蛋白質和RNA。循環外泌體通過將外泌體貨物分子從供體轉移到受體而在各種生理病理學過程中發揮核心作用。外泌體可以包裹與癌癥相關的microRNA(參與基因表達調控的約22個核苷酸的小非編碼RNA)，并在血液中穩定循環，從而促進癌癥的發展和進展。因此，外泌體微RNA(miRNA)已被評估為早期無創檢測癌癥的可靠生物標志物，比外周血中的miRNA具有更好的診斷價值。然而，由于外泌體miRNA含量低，以及外泌體脂質雙層對miRNA的保護，直接檢測外泌體內的miRNA仍然是一項艱巨的挑戰。

發明內容

發明目的：本發明的目的為提供一種實現對外泌體中多種miRNA的特異性檢測的外泌體內多種miRNA特異性檢測方法。

技術方案：本發明的外泌體內多種miRNA特異性檢測方法，包括如下步驟：

(1)構建非天然核酸框架探針結構；

(2)將非天然核酸框架探針結構與外泌體樣品共孵育，通過熒光分析檢測多種miRNA。

進一步地，由于核酸納米結構可以實現多種結構，并且具有修飾位點的可尋址性，非天然核酸框架探針結構包括不同形狀的框架探針結構。

由于非天然核酸具有更高的酶穩定性、熱穩定性等特性，可以實現在生物樣品中的穩定檢測。步驟(2)中，對外泌體內miRNA的檢測為原位檢測。非天然核酸框架探針結構進入外泌體中進行檢測。非天然核酸框架探針結構對多種miRNA的同時檢測。

優選的，非天然核酸框架探針結構結合多種納米夾子，通過改變納米夾子的序列，實現對不同目標miRNA分子的特異性結合。

步驟(1)中，不同非天然核酸框架探針結構的制備，基于核酸納米結構的可塑性和可尋址性，可以選擇任意形狀的結構；基于熒光分子的多樣性，選擇任意熒光分子修飾于非天然核酸框架探針結構。基于非天然核酸分子的堿基配對能力，選擇任意非天然核酸分子進行結構組裝。

步驟(2)中，當體系中存在目標miRNA時，會與非天然核酸夾子進行堿基互補配對，使熒光基團與淬滅基團分開，從而使非天然核酸框架探針發出熒光；而當體系中不存在目標miRNA時，非天然核酸框架探針不會發出熒光，從而保證了檢測的特異性。

步驟(1)具體包括：設計合成非天然核酸單鏈形成的框架結構與夾子結構。框架結構頂點處伸出捕獲單鏈與夾子結構互補配對。夾子結構的一條單鏈修飾有熒光淬滅基團和熒光基團，另外兩條單鏈具有與目標miRNA互補的粘性末端。可以針對檢測目標的種類和環境，更改框架結構上連接的納米夾子的數量和種類。

步驟(2)具體包括：將步驟(1)中構建的非天然核酸框架探針結構與待測外泌體共孵育，前者進入外泌體內與目標miRNA結合后，納米夾子上的淬滅基團與熒光基團分離，通過熒光檢測平臺觀察熒光的變化。

有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下顯著優點：