[發明專利]一種冬棗優良突變體選種的鑒定方法

有效

• 申請號: 202011402582.8
• 申請日: 2020-12-04
• 公開（公告）號: CN112575070B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 任曉琴;文昊;劉太林;楊靜慧;李冰;張超;王興;趙欣迪;趙楊;宋齊
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6869;C12Q1/6895;A01H1/04
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 趙瑤瑤

1.一種冬棗優良突變體選種的鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)試驗地的選擇，在該試驗地栽種三種不同品種的冬棗植株；

2)根據果實品質指標范圍初步篩選出優良單株，其中，果實品質指標包括平均單果重、含水量、可溶性糖、可滴定酸、可溶性固形物以及糖酸比，其指標范圍為平均單果重為16.011g—23.167g；含水量為65.02％—72.7％；可溶性糖為19.572％—30.216％；可滴定酸為0.261％—0.355％、可溶性固形物為23.78％—33.17％；糖酸比為66.859—85.115，；再對優良單株根據其對應的果實品質指標進行隸屬函數值計算，并對得到的隸屬函數值進行標記，將隸屬函數值大于0.456的冬棗植株標記為變異株，隸屬函數值范圍在0.144—0.456的冬棗植株標記為對照組；

3)將獲得標記為變異株的冬棗植株與標記為對照組的冬棗植株從生長發育、果實品質、結果特性、形態指標進行對比；

4)將獲得標記為變異株的冬棗植株與標記為對照組的冬棗植株進行RAPD多態性分析，驗證變異株的遺傳物質是否發生變化；其中RAPD多態性分析采用以下步驟：a)提取變異株以及對照組的冬棗植株棗葉的全基因組DNA，b)篩選3對多態性帶最多的引物進行PCR擴增；c)對比變異株和對照組的冬棗植株的擴增結果，擴增結果呈現多態性條帶數最多的變異株即為冬棗植株突變體；d)對PCR擴增結果進行檢測；

5)根據步驟3)和步驟4)的鑒定結果判斷標記為變異株的冬棗植株是否為真正突變體；

6)將步驟5)判斷得到的正真突變體的冬棗植株進行基因轉錄組高通量測序，進行最終鑒定。

2.根據權利要求1所述的冬棗優良突變體選種的鑒定方法，其特征在于：所述步驟1)試驗地選擇土壤類型為黏壤土，pH為7.8，含鹽量為0.18％。

3.根據權利要求1所述的冬棗優良突變體選種的鑒定方法，其特征在于：所述步驟1)試驗地選擇的試驗地面積120畝，三種不同品種的冬棗植株選為大港冬棗、沾化冬棗、沾冬2號3個品種，樹齡平均為10年，試驗地內棗樹南北向栽植，株行距1.5m×3m。

4.根據權利要求1所述的冬棗優良突變體選種的鑒定方法，其特征在于：所述PCR擴增結果的檢測方法為：A)制膠；B)左右灌膠；C)上樣與電泳：將擴增產物在瓊脂糖凝膠上電泳，電泳緩沖液位1×TBE，每個點樣孔加5μL樣品，75伏恒電壓下電泳約45分鐘；D)凝膠分析:待電泳完后，將凝膠移入凝膠成像系統中，掃描拍照,統計凝膠電泳條帶數量與結果，計算遺傳相似系數。

5.根據權利要求1所述的冬棗優良突變體選種的鑒定方法，其特征在于：所述PCR擴增體系為：25mmol/LMgCl22μL，10×PCR緩沖液2.5μL，10ng/μL引物1μL，50ng/μL DNA 2μL，2mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，雙蒸水15.2μL。

6.根據權利要求1所述的冬棗優良突變體選種的鑒定方法，其特征在于：所述PCR擴增反應程序為：94℃預變性2min；94℃變性30s，37℃退火40s，72℃延長60s，40個循環；72℃延長10min；4℃保溫∞。

7.根據權利要求1所述的冬棗優良突變體選種的鑒定方法，其特征在于：所述擴增結果呈現多態性是指擴增條帶增多或擴增條帶減少。