[發明專利]BST1作為結核病診斷分子標識的用途

在審

• 申請號: 202011396477.8
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN112481370A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 金奇;張笑冰;劉立國
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院病原生物學研究所
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;G01N33/68
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

1.檢測分子標記物BST1表達水平的試劑在制備診斷結核病的試劑盒的應用。

2.檢測BST1蛋白水平改變在制備診斷結核病試劑盒的應用。

3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，檢測分子標記物BST1表達水平方法為熒光定量PCR法。

4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，檢測分子標記物BST1表達水平的試劑制備診斷活動性結核病的試劑盒中的應用。

5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用包括用于區分活動性結核病患者、結核潛伏感染以及非活動性肺結核非潛伏感染者。

6.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述結核病為肺結核或肺外結核。

7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，該試劑盒還包括如下組分：

特定細胞富集抗體標記磁珠，Dynabeads CD15(Invitrogen，US)；細胞總RNA提取試劑盒，RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Germany)；cDNA反轉錄酶，SuperScript^TM IV VILO^TMMaster Mix(Invitrogen，US)；qPCR熒光定量PCR檢測體系，包括TaqManTM Fsat AdvancedMaster Mix(Thermo Fishen Scientific,US)，Assay BST1外顯子區域特異性檢測引物及探針。

8.BST1在制備結核病診斷標記物的產品中的應用。

9.BST1在制備診斷結核病的醫療器械中的應用，所述的診斷結核病的醫療器械以BST1作為診斷分子標記物。

10.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，試劑盒的檢測方法，包括以下步驟：

1)全血樣本處理

吸取0.8ml混勻全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6mL的4℃預冷的分離液，吹吸混勻；加入CD15⁺磁珠(Invitrogen，US)并迅速向稀釋好的血液中加入一份磁珠，蓋緊蓋子，將流式管妥善安置在Hula Mixer(Invitrogen，US)上，4℃，8rpm旋轉孵育20min，

2)磁性分離

⑴取出孵育好的細胞，瞬時離心，在磁力架上靜置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6mL分離液，輕輕吹勻后轉移至對應2mL蛋白低吸附管，磁力架上靜置2min，吸去上清，

⑶從磁力架上取下，加入1.6mL分離液，輕輕吹勻，磁力架上靜置2min，吸去上清，重復1次，

⑷加入350μL的Buffer RLT裂解細胞，渦旋震蕩1min，4℃放置備用，

3)總RNA提取

采用RNeasy Plus Mini Kit對磁珠分選的中性粒細胞總RNA進行提取，具體操作如下：

⑴配制反應體系1和反應體系2

將細胞裂解液在磁力架上靜置2min，吸取細胞裂解液轉移至gDNA去除柱中，12,000rpm離心30s；

⑵向流穿液中加入350μL 70％乙醇，混勻，轉移700μL至RNeasy Mini柱中，12,000rpm，離心15s，棄去流穿液，

⑶加入700μL Buffer RW1，12,000rpm，離心15s，棄去流穿液，

⑷加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，離心15s，棄去流穿液，

⑸加入500μL Buffer RPE，12,000rpm，離心2min，更換新的收集管，開蓋全速離心1min，

⑹將RNeasy Mini柱放入標記好編號的1.5mL的EP管，向柱膜中心加入30μL水，靜置1min，12,000rpm，離心1min，所得RNA冰上放置備用，

4)cDNA的合成

取細胞總RNA，采用SuperScript^TM IV VILO^TM Master Mix進行反轉錄，得到細胞樣本cDNA，

5)實時熒光定量PCR檢測BST1基因的相對表達量

采用上步驟中制備的cDNA為模板，對BST1特異引物對或內參引物對進行實時定量PCR，進而得到各個樣本模板中BST1基因的相對表達量。