[發明專利]一種重組腺相關病毒的制備方法、系統及重組桿粒

有效

• 申請號: 202011393359.1
• 申請日: 2020-12-03
• 公開（公告）號: CN112553257B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 武漢樞密腦科學技術有限公司
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/35;C12N7/01;C12R1/93
• 代理公司: 武漢華之喻知識產權代理有限公司 42267
• 代理人: 彭翠;曹葆青

1.一種重組腺相關病毒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)構建包含生產重組腺相關病毒的重組桿狀病毒基因組的重組桿粒；所述重組桿狀病毒基因組中包含生產所述重組腺相關病毒的必需功能元件，所述必需功能元件包括Cap基因、Rep基因以及帶有外源目的基因的核心表達元件ITR-GOI；

(2)將步驟(1)獲得的包含生產重組腺相關病毒的重組桿狀病毒基因組的重組桿粒轉染到宿主細胞系培養；

其中，所述必需功能元件中的至少一個被插入到所述重組桿狀病毒基因組必需基因基因座的N末端或C末端；所述桿狀病毒基因組必需基因的基因座選自Ac6、Ac9、Ac10、Ac17、Ac66、Ac109、Ac139、Ac135、Ac98、Ac147和Ac128；

其中，所述必需功能元件中的至少一個被插入到所述重組桿狀病毒基因組必需基因基因座的N末端或C末端，是指所述必需功能元件中的至少一個位于所述重組桿狀病毒基因組必需基因表達框的3kb范圍內。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述必需功能元件中的至少一個被插入到所述重組桿狀病毒基因組必需基因基因座的N末端或C末端，是指所述必需功能元件中的至少一個位于所述重組桿狀病毒基因組必需基因表達框的1.5kb范圍內。

3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)具體為：構建包含生產所述重組腺相關病毒的必需功能元件的同源重組載體；或者構建包含生產所述重組腺相關病毒的必需功能元件的同源重組載體和穿梭質粒，利用同源重組的方法將生產所述重組腺相關病毒的三個必需功能元件整合到同一個包含重組桿狀病毒基因組的重組桿粒中，獲得包含生產所述重組腺相關病毒必需功能元件的重組桿狀病毒基因組的重組桿粒；

其中，所述同源重組載體包括靶向桿狀病毒必需基因，且該載體中攜帶Cap基因表達框、Rep基因表達框和ITR-GOI中的至少一種。

4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，其余必需功能元件被插入到所述重組桿狀病毒基因組非必需基因的基因座中。

5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)具體包括如下子步驟：

(1-1)構建包含Cap基因表達框、Rep基因表達框以及帶有外源目的基因的核心表達元件ITR-GOI的一個或多個同源重組載體；

(1-2)利用步驟(1-1)獲得的一個或多個同源重組載體，將Cap基因表達框、Rep基因表達框以及帶有外源目的基因的核心表達元件ITR-GOI整合，使其插入到重組桿狀病毒基因組一個或多個必需基因基因座的N末端或C末端，獲得包含生產所述重組腺相關病毒所有必需功能元件的重組桿狀病毒基因組的重組桿粒。

6.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)具體包括如下步驟：

(1-1)構建包含所述必需功能元件中的一個或兩個元件的同源重組載體；然后通過Red同源重組將該同源重組載體中的AAV必需功能元件插入到桿狀病毒基因組一個或兩個必需基因基因座的N末端或C末端；

(1-2)構建包含其余必需功能元件的穿梭質粒；

(1-3)通過穿梭質粒介導的Tn7重組將Cap基因表達框、Rep基因表達框以及帶有外源目的基因的核心表達元件ITR-GOI整合在一個桿狀病毒基因組中，獲得包含生產所述重組腺相關病毒所有必需功能元件的重組桿狀病毒基因組的重組桿粒。