[發明專利]水稻蘋果酸合酶基因在調控粒型中的應用

在審

• 申請號: 202011393060.6
• 申請日: 2020-12-02
• 公開（公告）號: CN112626045A
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 何永奇;王州飛;趙佳
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/82;A01H6/46;A01H5/10;C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.兩個來自水稻α-異丙基蘋果酸合酶基因OsIPMS1和OsIPMS2，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

2.權利要求1所述的水稻α-異丙基蘋果酸合酶基因OsIPMS1和OsIPMS2編碼的蛋白，其氨基酸序列SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

3.權利要求1所述的水稻OsIPMS1和OsIPMS2基因或權利要求2中所述的OsIPMS1和OsIPMS2蛋白在篩選或培育大粒水稻品種中的應用。

4.根據權利要求3所述的基因水稻突變體獲得和基因功能驗證，其特征在于包括如下步驟：

(1)獲得水稻OsIPMS1和OsIPMS2基因的核苷酸序列及氨基酸序列；

(2)用PCR獲得OsIPMS1和OsIPMS2基因的目標片段，將基因的目標片段構建到CH載體中；

(3)將步驟(2)得到的帶有OsIPMS1和OsIPMS2基因的目標片段的CH載體構建到pCAMBIA1300載體上，獲得p1300-CH-Target載體；

(4)將步驟(3)得到的帶有OsIPMS1和OsIPMS2基因目標片段的質粒轉化農桿菌；將帶有轉化質粒的農桿菌轉化水稻；

(5)水稻突變體篩選與鑒定，并鑒定種子粒型。

5.根據權利要求4所述的基因突變體獲得方法，其特征在于：利用從水稻cDNA為模板PCR克隆出該基因的引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

進一步的，在步驟(2)中將OsIPMS1和OsIPMS2基因中20bp的目標片段與CH載體相連，獲得CH-Target重組載體。

在步驟(3)中，用EcoRI HF和Hind III分別酶切pCAMBIA1300和CH-target載體，酶切產物用1.2％的瓊脂糖凝膠檢測，分別切膠回收載體pCAMBIA1300和片段CH-target；利用T4Ligase獲得p1300-CH-Target載體。

在步驟(5)中構建的水稻OsIPMS1和OsIPMS2 CRISPR/Cas9突變體gRNA靶序列如序列表SEQ ID NO.7所示；篩選純合突變體所用上游引物序列如序列表SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示。水稻種子粒型鑒定包括粒長、粒寬和千粒重。

6.根據權利要求3所述的一種檢測種子發育期OsIPMS1和OsIPMS2基因表達水平的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)取不同發育期水稻種子；

(2)用TransZol Plant kit(Transgen,www.transgen.com)試劑盒提取各個樣的RNA；

(3)用II Reverse Transcriptase system(Vazyme Biotech Co.,Ltd)試劑盒反轉錄形成cDNA，以其為模板；

(4)用熒光定量PCR進行分析，熒光定量PCR檢測引物序列，所述上游引物序列如序列表SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13所示，所述下游引物序列如序列表SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15所示。

7.根據權利要求6所述的檢測種子發育期OsIPMS1和OsIPMS2基因表達水平的方法，其特征在于：在步驟(1)中水稻種子分別在開花后0、7、14、21、28、35、42d后取樣；種子經液氮冷凍處理后迅速磨成粉末，樣品貯存于-80℃，每個時間點取樣三份。

在步驟(4)中，采用水稻內參基因18sRNA引物，所述上游引物的序列如序列表SEQ IDNO.16所示，所述下游引物的序列如序列表SEQ ID NO.17所示。