[發明專利]一種細胞培養液的收獲方法

在審

• 申請號: 202011392556.1
• 申請日: 2020-12-02
• 公開（公告）號: CN112899235A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 楊忠華;秦婷;王亞東;黃海峰;王曉玉
• 申請（專利權）人: 信達生物制藥（蘇州）有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C07K16/46
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

1.一種細胞培養液的收獲方法，所述方法包括以下步驟：

1)提供宿主細胞，對宿主細胞進行種子復蘇、搖瓶擴增培養和流加培養，得到細胞密度不小于1.0×10⁶個/mL的細胞培養物；

2)向步驟1)中所述細胞培養物中添加酸性溶液，調節細胞培養物的pH為4.0～5.6，其中所述酸性溶液含有枸櫞酸、醋酸、磷酸、正辛酸及其鹽中的一種及一種以上；

3)對步驟2)所述的細胞培養物進行深層過濾和/或添加堿性溶液，得到細胞培養液，其中所述堿性溶液含有Tris、Tris-bis、組氨酸中的一種及一種以上；

4)收獲步驟3)所述的細胞培養液。

2.根據權利要求1所述的細胞培養液的收獲方法，其特征在于，在步驟3)中首先對步驟2)所述的細胞培養物進行深層過濾，得到細胞收集液，然后再向所述細胞收集液中添加堿性溶液、將所述細胞收集液的pH調節為5.0～8.0，從而得到相應的細胞培養液；優選的，在所述步驟2)之前或者在所述步驟2)之后額外增加對所述細胞培養物進行連續流離心機離心的操作。

3.根據權利要求1所述的細胞培養液的收獲方法，其特征在于，在步驟3)中首先向步驟2)所述的細胞培養物中添加堿性溶液、將所述細胞培養物的pH調節為5.0～8.0，然后再將所述細胞培養物進行深層過濾，從而得到相應的細胞培養液；優選的，在添加堿性溶液、將所述細胞培養物的pH調節為5.0～8.0之后或者在所述步驟2)之前額外增加對所述細胞培養物進行連續流離心機離心的操作。

4.根據權利要求1～3任一項中所述的細胞培養液的收獲方法，其特征在于，在步驟1)中使用基礎培養基M對所述宿主細胞進行種子復蘇和搖瓶擴增，使用流加試劑A和流加試劑B對所述宿主細胞進行流加培養；

其中，所述基礎培養基M溶解后pH為7.3～7.5，濁度為0.5～1NTU，滲透壓為300～350mOsm/kg，葡萄糖含量為5～6g/L，其中谷氨酰胺、羥脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸的含量均小于40μmol/L；

所述流加試劑A溶解后pH為6.5～6.8，濁度為1.5～2.5NTU，滲透壓為1500～1800mOsm/kg，葡萄糖含量75.02g/L，其中天門冬氨酸、谷氨酸、天門冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和脯氨酸的含量均大于10000μmol/L；

所述流加試劑B溶解后pH為11～11.5，濁度為1～1.5NTU，滲透壓為1200～1500mOsm/kg，其中組氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10000μmol/L；

優選的，在所述流加培養中，當溶液中葡萄糖的濃度低于4.0g/L時，補加葡萄糖使溶液中葡萄糖的濃度提高到5.0g/L，并根據實際泡沫量加入總量不超過100ppm的消泡劑。

5.根據權利要求4所述的細胞培養液的收獲方法，其特征在于：

所述基礎培養基M中天門冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述基礎培養基M中不包含谷氨酰胺、羥脯氨酸、丙氨酸、肌氨酸和脯氨酸；

所述流加試劑A中谷氨酸、絲氨酸、亮氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述流加試劑A中不含組氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、正纈氨酸、羥脯氨酸和肌氨酸；

所述流加試劑B中組氨酸、酪氨酸、胱氨酸和色氨酸的含量均大于10％(w/w)，且所述流加試劑B中不含天門冬酰胺、蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、正纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、羥脯氨酸和肌氨酸；優選的，所述流加試劑B中酪氨酸的含量為45～55％(w/w)。

6.根據權利要求5所述的細胞培養液的收獲方法，其特征在于，所述基礎培養基M、流加試劑A和流加試劑B中的氨基酸組成如表1所示。

7.根據權利要求1～6任一項中所述的細胞培養液的收獲方法，其特征在于，所述深層過濾中使用的膜包選自Millipore公司的D0HC、D0SP、X0HC、X0SP、20MS、40MS系列中的任意一種或任意兩種的組合；優選的，所述膜包的過濾載量大于等于60升每平方米。