[發明專利]結核分枝桿菌的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒及其專用引物和探針

有效

• 申請號: 202011389474.1
• 申請日: 2020-12-02
• 公開（公告）號: CN113512597B
• 公開（公告）日: 2022-07-08
• 發明（設計）人: 居金良;崔振玲;葛俊楠;沈曉寧
• 申請（專利權）人: 上海仁度生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

1.一種結核分枝桿菌的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，包括：

（1）核酸提取液：其包含含有特異性捕獲探針的固相支持物和提取探針，其中所述特異性捕獲探針用于捕獲檢測序列，所述提取探針用于與靶標序列特異性結合；

（2）檢測液a：其包含第二引物，所述第二引物與第一引物配合，用于擴增靶標序列；

（3）檢測液b：其包含第一引物和靶標檢測探針，其中所述靶標檢測探針與所述靶標序列的擴增產物RNA拷貝特異性結合；

（4）SAT酶液：其包含至少一種RNA聚合酶和M-MLV反轉錄酶；

其中所述特異性捕獲探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述提取探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述靶標檢測探針的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：

（5）樣品預處理液：其包含胍鹽、去垢劑和巰基還原劑中的至少一種。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述樣品預處理液的組分為：3～5M的胍鹽和/或0.1～10%的去垢劑和/或0.1～3%的巰基還原劑、10～100mM 的Tris-HCl、0.1～0.5mM 的EDTA，pH≤6.9。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述胍鹽選自鹽酸胍、異硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一種或多種；所述去垢劑選自十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰中的一種或多種；所述巰基還原劑選自半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、DTT中的一種或多種。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的試劑盒，其特征在于，

所述核酸提取液的組分為：250～800mM HEPES、50～500mg/L磁珠、1～50μΜ所述的特異性捕獲探針、25～150pmol/mL所述的提取探針；

所述檢測液a的組分為：10～50mM Tris，5～40 mM KCl，10～40mM MgCl₂，1～20mM NTP，0.1～10mM dNTPs，1～10% PVP40，250~750 pmol/mL所述的第二引物；

所述檢測液b的組分為：10～50mM Tris，5～40mM KCl，10～40mM MgCl₂，1～20mM NTP，0.1～10mM dNTPs，1～10% PVP40，143~857 pmol/mL所述的第一引物，143~857 pmol/mL所述的靶標檢測探針；

所述SAT酶液的組分為：16000~160000U/mL的M-MLV反轉錄酶、8000~80000U/mL的RNA聚合酶、2～10mM HEPES pH7.5、10～100 mM N-乙酰-L-半胱氨酸、0.04～0.4 mM 醋酸鋅、10～100 mM 海藻糖、40～200 mM Tris-HCl pH 8.0、40～200mM KCl、0.01～0.5mM EDTA、0.1～1% (v/v) Triton X-100和20～50% (v/v) 甘油。

6.根據權利要求1-4中任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：

（6）洗滌液：其含有NaCl和SDS；和/或

（7）礦物油；和/或

（8）陽性對照：含結核分枝桿菌核酸的體系；和/或

（9）陰性對照：不含有結核分枝桿菌核酸的體系。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，

所述洗滌液的組分為：HEPES 5～50mM，NaCl 50～500 mM，0.5～1.5% SDS，EDTA 1～10mM；

所述陽性對照為：含10²～10⁵CFU/mL結核分枝桿菌的菌液。