[發(fā)明專利]一種非酒精性脂肪性肝炎的miRNA標(biāo)志物的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011387404.2
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號(hào): CN112522383A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 梁廷明;沈璐璐;馬敏娟;段瑞;賈琳
• 申請（專利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)常州創(chuàng)新發(fā)展研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6806;C12N15/113
• 代理公司: 蘇州國卓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32331
• 代理人: 張入文

1.一種非酒精性脂肪性肝炎的miRNA標(biāo)志物的制備方法，其特征在于：它的操作步驟如下：

步驟(一)、從NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中篩選出2個(gè)符合條件的人非酒精性脂肪性肝炎，即，NASH相關(guān)模型miRNA測序數(shù)據(jù)集和7個(gè)符合條件的小鼠NASH相關(guān)模型的miRNA測序數(shù)據(jù)集，下載這些數(shù)據(jù)集然后分別進(jìn)行miRNA差異表達(dá)分析并取交集；

步驟(二)、分別對(duì)步驟(一)中得到的9個(gè)miRNA測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異miRNA的表達(dá)分析，得到9組差異表達(dá)miRNA；取9組差異表達(dá)miRNA的交集，得到在人和小鼠NASH中都差異表達(dá)的miRNA；

步驟(三)、根據(jù)文獻(xiàn)資料，構(gòu)建蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型，并記錄小鼠體重；小鼠NASH模型構(gòu)建成功后，進(jìn)行小鼠眼球取血并通過頸椎脫臼法處死小鼠，進(jìn)行解剖取組織樣，一部分用甲醛固定，一部分放-80攝氏度冰箱保存待用；解剖時(shí)進(jìn)行小鼠肝臟拍照；

步驟(四)、將步驟(三)中得到的血清進(jìn)行甘油三脂和總膽固醇的檢測，得到小鼠NASH模型中的血清學(xué)指標(biāo)，再次確認(rèn)小鼠模型構(gòu)建成功；

步驟(五)、將步驟(三)中得到的一部分用甲醛固定小鼠肝組織進(jìn)行蘇木精伊紅染色和油紅染色，檢測NASH模型鼠肝臟中脂質(zhì)積累情況；

步驟(六)、將步驟(三)中得到的一部分放-80攝氏度冰箱保存待用的小鼠肝組織分別提取總RNA；

步驟(七)、將步驟(六)中得到的小鼠肝組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；

步驟(八)、以步驟(七)中得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，檢測步驟(二)中得到的人和小鼠NASH中都差異表達(dá)的miRNA；

步驟(九)、將步驟(八)中得到的miRNA表達(dá)結(jié)果與步驟(二)中的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，選取表達(dá)趨勢一致，且表達(dá)差異最明顯的2種miRNA作為判斷非酒精性脂肪性肝炎的標(biāo)志物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的miRNA標(biāo)志物的制備方法，其特征在于：所述的步驟(一)中所述的NASH miRNA測序數(shù)據(jù)集，是從GEO數(shù)據(jù)庫中搜索的數(shù)據(jù)集，經(jīng)過條件篩選得到，篩選條件為：HFD、NAFLD、NASH、miRNA、tissue；每個(gè)數(shù)據(jù)集最少包含5個(gè)樣本的正常組和5個(gè)樣本的處理組；每個(gè)數(shù)據(jù)集有一個(gè)數(shù)據(jù)矩陣，行名為miRNA名稱，列名為樣本名稱。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的miRNA標(biāo)志物的制備方法，其特征在于：所述的步驟(二)中分別對(duì)得到的9個(gè)miRNA測序數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異miRNA的表達(dá)分析，利用R語言中l(wèi)imma包進(jìn)行差異miRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)分析，上述差異miRNA表達(dá)分析的閾值條件均設(shè)置為：|log₂FC|1，且FDR0.05；FC為差異倍數(shù)，F(xiàn)DR為偽發(fā)現(xiàn)率；滿足閾值條件的基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因；分別得到9組差異表達(dá)的miRNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的miRNA標(biāo)志物的制備方法，其特征在于：所述的步驟(二)中得到的人和小鼠NASH中都差異表達(dá)的miRNA包括miR-210、miR-222、miR-301a-3p、miR-532-5p。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的miRNA標(biāo)志物的制備方法，其特征在于：所述的步驟(三)中的小鼠NASH模型是利用MCD飲食誘導(dǎo)構(gòu)建的，周期為2-3周，所用小鼠為6-8周的C57BL/6J小鼠；血樣是通過小鼠眼球取血獲得，分為兩份，一份用于檢測血樣中的甘油三脂TG、總膽固醇含量TC、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量；另一份用于檢測血樣中的miRNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種非酒精性脂肪性肝炎的miRNA標(biāo)志物的制備方法，其特征在于：所述的步驟(九)中所檢測miRNA在NASH小鼠模型肝臟中的表達(dá)趨勢與步驟(二)中得到的在人和小鼠NASH中差異表達(dá)的miRNA表達(dá)趨勢一致，分別是miR-301a-3p和miR-532-5p這兩種miRNA。