[發明專利]一種基于ISET原理的循環腫瘤細胞IHC抗原修復方法

在審

• 申請號: 202011385765.3
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號: CN112485426A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 馬瑩;李浩;張建波;李勝;高德海;夏梅
• 申請（專利權）人: 山東省藥物研究院
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/574
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

本發明屬于生物醫學領域，具體涉及一種基于ISET原理的循環腫瘤細胞IHC抗原修復方法。該方法包括以下步驟：在水浴鍋加入0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液，加熱至95℃，放入用磁鐵固定后的一張循環腫瘤細胞玻片加熱15分鐘；修復完成后，取出玻片，使用PBS洗2min*3次。本發明提供的抗原熱修復后，對循環腫瘤細胞IHC染色效果好，且能夠減少因抗原修復造成的假陽性；本發明進一步完善循環腫瘤細胞檢測鑒定技術體系。

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，具體涉及一種基于ISET原理的循環腫瘤細胞IHC抗原修復方法。

背景技術

由于石蠟切片標本多數使用甲醛固定，甲醛在組織中所形成的醛鍵、羧甲基等封閉了部分抗原決定簇，或由于蛋白分子之間的交聯而使抗原決定簇隱蔽。因此在染色前有些抗原需要先進行抗原修復或暴露才能使組織中的抗原抗體充分結合，出現理想的染色結果。而對于需要進行修復的抗原，需在建立染色程序時確定。常用的方法有加熱抗原修復法和酶消化法兩種。經大量試驗驗證．加熱抗原修復法優于酶消化法，其機制目前仍不清楚，可能是加熱打開了組織抗原因甲醛固定所引起的抗原決定簇的交聯，因此使免疫組織化學染色的敏感度大幅度提高。石蠟包埋組織會因固定過程中蛋白抗原活性的丟失而導致染色變淺，造成檢測結果的假陰性，此外，固定劑的類型等也會影響到染色結果，而抗原修復為了彌補固定過程中抗原活性的丟失，但是，抗原的修復也會造成一定程度的非特異性染色，導致檢測結果的假陽性。現有技術中，尚未有針對循環腫瘤細胞進行修復的相關記載。

發明內容

針對現有技術中存在的問題，本發明提供了一種基于ISET原理的循環腫瘤細胞IHC抗原修復方法。

本發明為了實現上述目的所采用的技術方案為：

本發明提供了一種基于ISET原理的循環腫瘤細胞IHC抗原修復方法，包括以下步驟：

（1）在水浴鍋加入0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液，加熱至95℃，放入用磁鐵固定后的一張循環腫瘤細胞玻片加熱15分鐘；

（2）修復完成后，取出玻片，使用PBS洗2min*3次。

進一步的，所述枸櫞酸鈉緩沖溶液的pH值為6.0。

本發明還提供了一種利用上述抗原修復方法修復后循環腫瘤細胞的免疫組化檢測方法，包括以下步驟：

1）將修復后的循環腫瘤細胞玻片中滴加100μl 0.1% Triton X-100，室溫孵育15min，DI水洗2min×3次；

2）滴加100μl 0.3% H₂O₂，室溫下孵育10min，PBS洗2min×3次；

3）滴加100μl一抗工作液，室溫下孵育2h，PBS洗2min×3次；

4)滴加100μl山羊抗兔/小鼠 IgG/HRP，室溫下孵育15-30min，PBS洗2min×3次；

5)滴加100μl DAB顯色液，室溫下孵育3～10min；

6）顯色完成后，棄掉DAB顯色液，流水沖洗5min，蘇木素染色15min；

7）過水漂洗1秒，鹽酸酒精分化3-8秒，自來水返藍15min；

8）75%乙醇（1min），95%乙醇（1min），100%乙醇（1min）梯度乙醇脫水，晾干，中性樹脂封片。

9）光學顯微鏡下鏡檢。

進一步的，步驟3）中，所述一抗工作液為CD45+CD31。

上述一抗工作液具體制備過程為：取100μlCD45一抗工作液，加入1μlCD31一抗濃縮液混勻即可。

進一步的，所述梯度乙醇具體脫水過程為：75%乙醇脫水1min，95%乙醇脫水1min，100%乙醇脫水1min。

本發明具體的實驗路線如圖1所示。