[發(fā)明專利]一種治療COVID-19的基因改造干細胞

在審

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• 申請日: 2020-11-22
• 公開（公告）號: CN112553164A
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發(fā)明（設計）人: 翁炳煥
• 申請（專利權）人: 翁炳煥
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/867
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種治療COVID-19的基因改造干細胞，其特征在于，將新冠病毒的易感基因ACE2插入已被SV40LT和/或hTERT轉(zhuǎn)染的永生化干細胞DNA中，制備易被新冠病毒感染的易感干細胞，進而將新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干擾序列shRNA插入所制易感干細胞DNA中，構建既能通過ACE2將新冠病毒吸入干細胞內(nèi)又能通過shRNA靶向干擾新冠病毒在干細胞內(nèi)復制并能在體外無限傳代擴增的基因改造干細胞。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種治療COVID-19的基因改造干細胞，其特征在于，所述干細胞包括胚胎干細胞、成體干細胞、間充質(zhì)干細胞、肺干細胞或誘導肺干細胞。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種治療COVID-19的基因改造干細胞，其特征在于，所述插入基因包括重組慢病毒載體的構建、重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞進行慢病毒的包裝、干細胞的慢病毒轉(zhuǎn)染、基因改造干細胞的篩選和鑒定。

4.根據(jù)權利要求1、3所述的一種治療COVID-19的基因改造干細胞，其特征在于，所述重組慢病毒載體的構建包括將新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干擾序列shRNA和/或?qū)⑿鹿诓《疽赘谢駻CE2克隆到慢病毒載體的多克隆位點。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種治療COVID-19的基因改造干細胞，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列見“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候選序列”。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種治療COVID-19的基因改造干細胞，其特征在于，擴增所述hACE2基因的上游引物為：CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3；下游引物為：EF1-Rn：5’-GCCAGTACACGACATCACTT-3’；β-actin的上游和下游引物分別為：5’-TGGACTTCGAGCAAGAGATGG-3’、5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3’。

7.權利要求1所述的一種治療COVID-19的基因改造干細胞，其特征在于，按以下步驟制備：

(1)獲得間充質(zhì)干細胞：從干細胞樣本庫、產(chǎn)前診斷后剩余羊水細胞、新生兒臍帶血細胞、臍帶組織或胎盤組織細胞中分離、誘導羊水成纖維細胞、間充質(zhì)干細胞或肺干細胞。

(2)給干細胞裝配永生化基因：構建攜帶hTERT和/或SV40LT的重組載體，轉(zhuǎn)染干細胞，使hTERT和/或SV40LT整合到干細胞DNA，制備能無限傳代的永生化干細胞或肺干細胞。

(3)給干細胞裝配新冠病毒易感基因：將血管緊張素轉(zhuǎn)換酶II基因連接慢病毒表達載體pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU，分別構建重組質(zhì)粒pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，將重組質(zhì)粒pHBLV-OE-ACE2和包裝質(zhì)粒(psPAX2和pMD2G)或者將重組質(zhì)粒pGC-FU-ACE2和包裝質(zhì)粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分別共轉(zhuǎn)染293FT細胞，包裝攜帶ACE2的重組慢病毒OE-ACE2或FU-ACE2，將重組慢病毒轉(zhuǎn)染干細胞，使ACE2基因整合到干細胞DNA。

(4)給干細胞裝配新冠病毒RNA干擾基因：優(yōu)選新冠病毒(nCoV)的靶向干擾序列siRNA，合成shRNA模板，連接到慢病毒載體pHBLV或LV3，構建重組質(zhì)粒pHBLV-nCoV-N-shRNA或LV3-nCoV-N-shRNA，將重組質(zhì)粒pHBLV-nCoV-N-shRNA和包裝質(zhì)粒(pHBLV、psPAX2載體和pMD2G載體)或者將重組質(zhì)粒LV3-nCoV-N-shRNA和包裝質(zhì)粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共轉(zhuǎn)染293FT細胞，包裝攜帶shRNA的慢病毒，將慢病毒轉(zhuǎn)染干細胞，使shRNA基因整合到干細胞DNA上，使干細胞獲得能干擾nCoV在胞內(nèi)復制的新功能。

(5)制成一種人工裝配永生化基因、新冠病毒RNA干擾基因和易感基因從而兼具干細胞固有治療功能、人工永生化功能、新冠病毒RNA干擾功能和易感特性的基因改造干細胞。