[發明專利]一種H-蛋白突變體及其應用

有效

• 申請號: 202011383648.3
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號: CN112458073B
• 公開（公告）日: 2021-12-10
• 發明（設計）人: 曾安平;張涵;任杰;許穎穎;李宇辰;聶晶磊
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于蛋白質工程領域。具體涉及利用蛋白質工程的定點突變技術改良H?蛋白，進而提高或降低甘氨酸裂解酶系酶活。本發明通過對甘氨酸裂解酶系的理性設計，提出一種提高甘氨酸裂解酶系酶活的突變策略，使得甘氨酸裂解酶系的酶活得到顯著提高，有效提高碳一合成路徑的效率，這不僅能夠提高上游對二氧化碳的吸收利用，同時能夠促進下游的循環發展，對癌癥，以及肥胖的治療都具有積極的作用；部分能有效的降低合成效率起到調控作用。

技術領域：

本發明屬于蛋白質工程領域。具體來講，涉及利用蛋白質工程的定點突變技術改良H-蛋白，進而調控甘氨酸裂解酶系酶活。

背景技術：

甘氨酸裂解系統(Glycine cleavage system,GCS)能夠可逆的催化甘氨酸裂解與合成反應，裂解反應將甘氨酸分解為二氧化碳和氨，與此同時，生成還原型輔酶(NADH)和一碳單元5,10-亞甲基四氫葉酸；合成反應以二氧化碳、氨、NADH和5,10-亞甲基四氫葉酸為原料合成甘氨酸。

甘氨酸裂解酶系由H，P，T，L四個蛋白組成，協同發揮作用。其中H蛋白作為組內的穿梭蛋白，以其硫辛酸臂連接其它三個功能蛋白的反應活性位點，進行循環反應。在代謝網絡中，GCS是絲氨酸、甘氨酸、一碳單元代謝的重要組成部分，與腫瘤細胞生長、人類高甘氨酸血癥、植物的光呼吸有密切關系。

我們通過對GCS反應機理進行研究，發現H-蛋白上關鍵氨基酸殘基的突變可以影響GCS的活力，通過H-蛋白定向改造，可以顯著提高或降低GCS的活力，進而定量可控的調節甘氨酸的合成及分解，這在腫瘤及神經性疾病治療和植物抗衰老抗逆方面都有廣闊的應用前景。

發明內容：

為了解決上述技術問題，本發明通過對甘氨酸裂解酶系的理性設計，提出一種改變甘氨酸裂解酶系酶活的突變策略，使得甘氨酸裂解酶系的酶活得到顯著提高，從而促進了碳一合成路徑的效率，有效提高了下游高附加值產物的產量；或使得酶活得到降低，進一步調控產物的合成。

本發明實現上述目的所采用的技術方案之一，是提供一種H-蛋白突變體，所述突變體是在SEQ ID NO.1(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)所示的H-蛋白原始序列上，發生了以下位點中的至少一個突變：

第12位的賴氨酸Lys(K)；第35位的谷氨酸Glu(E)；第68位的絲氨酸Ser(S)；第69位的天冬氨酸Asp(D)；或第71位的酪氨酸Tyr(Y)；

進一步地，第12位的賴氨酸Lys(K)突變為Ala(A)、Ser(S)、Asp(D)、Val(V)Thr(T)或Ile(I)；

進一步地，第35位的谷氨酸Glu(E)突變為Ala(A)、Ser(S)、Asp(D)、Val(V)Phe(F)或Arg(R)；

進一步地，第68位的絲氨酸Ser(S)突變為Cys(C)、Thr(T)、Val(V)、Pro(P)、Asp(D)、Trp(W)、Gly(G)或Ile(I)；

進一步地，第69位的天冬氨酸Asp(D)突變為Arg(R)、Leu(L)、Glu(E)、His(H)、Tyr(Y)、Lys(K)、Ile(I)、Thr(T)、Trp(W)、Met(M)、Val(V)、Cys(C)或Gly(G)；

進一步地，第71位的酪氨酸Tyr(Y)突變為Gly(G)、Ile(I)、Ala(A)、Ser(S)、Arg(R)、Val(V)、Phe(F)、Leu(L)、His(H)、Thr(T)、Trp(W)、Lys(K)或Met(M)。

SEQ ID NO.1:

MSNVPAELKYSKEHEWLRKEADGTYTVGITEHAQELLGDMVFVDLPEVGATVSAGDDCAVAESVKAASDIYAPVSGEIVAVNDALSDSPELVNSEPYAGGWIFKIKASDESELESLLDATAYEALLEDE.