[發明專利]鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的特異性引物和探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202011381246.X
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號: CN112251519A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 曹貴方;楊光;宋永利;竇傲蕾;馬騰;智達夫;蘇紅;劉默凝;楊宏新;霍雨佳;李喜和;何亭漪;楊燕燕;達來;李秀男
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 趙敬

1.一種鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的特異性引物和探針，其特征是，序列如下：

上游引物：5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’

下游引物：5’-GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’

探針：5’-GCTTGCCCCAGGGCACCCA-C3 Spacer-3’。

2.根據權利要求1所述的特異性引物和探針，其特征在于，所述探針為非標記探針，3’端用C3 Spacer封閉。

3.一種鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的試劑盒，包括權利要求1或2所述的特異性引物及探針，其特征在于，還包括如下成分：PCR反應混合液，呼倫貝爾短尾羊基因組DNA，呼倫貝爾短尾羊T/Brachyury基因純合子、雜合子所制備的標準品質粒。

4.根據權利要求3所述的一種鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應混合液包括HRM AnaiysisPreMix（2X）及RNase-Free ddH₂O。

5.一種鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的方法，包括如下步驟，其特征在于，所述熒光定量PCR反應體系包括權利要求1或2所述的特異性引物和探針：

(a)提取待測呼倫貝爾短尾羊血液基因組DNA樣品；

(b)熒光定量PCR反應體系擴增呼倫貝爾短尾羊Brachyury/T基因的片段序列，序列片段為純合、雜合短尾羊Brachyury/T基因的95879486位點至95879323位點，如SEQ ID NO：1的DNA序列所示；

(c)高分辨率熔解曲線法獲取步驟（b）擴增產物的高分辨率熔解曲線。

6.根據權利要求5所述的鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的方法，其特征在于，所述步驟（b）中PCR反應體系總體積為10ul，包括HRM AnaiysisPreMix(2X)5ul，上游引物0.2ul，下游引物0.2ul，上、下游引物濃度比例為1：10，10uM非標記探針0.2ul，50ng/ulDNA模板0.5ul，RNase-Free ddH₂O3.9ul。

7.根據權利要求5所述的鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的方法，其特征在于，所述PCR反應按照如下反應程序進行：95℃預變性：5min，95℃變性：5s，62℃退火：30s，擴增50個循環，收集熒光信號。

8.根據權利要求5所述的鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的方法，其特征在于，所述步驟（c）中高分辨率熔解曲線在60℃-95℃進行分析，在60℃反應1min，在95℃反應30s，升溫速率為0.2℃/s。

9.根據權利要求6所述的鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的方法，其特征在于：所述上游引物的濃度為1uM，下游引物的濃度為10uM。

10.根據權利要求6所述的鑒定呼倫貝爾短尾羊純合子、雜合子的方法，其特征在于，所述HRM AnaiysisPreMix包括飽和熒光EvaGreen染料。