[發(fā)明專利]血小板裂解物無血清分離培養(yǎng)臍帶間充質干細胞的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011381203.1
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112481202B
• 公開（公告）日: 2022-11-15
• 發(fā)明（設計）人: 肖海蓉
• 申請（專利權）人: 深圳博雅感知藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.分離培養(yǎng)原代臍帶間充質干細胞的方法，包括如下步驟：

(1)在生物安全柜中處理經(jīng)2-8℃冷鏈運輸至實驗室的臍帶樣本；

(2)D-Hanks充分清洗以去除表面血污，使用手術剪將臍帶剪成小段，置于平皿中，用手術鑷反復擠壓，清除組織中的殘留血塊，用D-Hanks清洗；

(3)剪開組織，剝除表皮，剔除動脈和靜脈，得到華通氏膠組織，將華通氏膠切割成小塊，稱重；

(4)按照規(guī)定組織量接種至培養(yǎng)瓶，再添加原代增補培養(yǎng)基，充分混勻，使組織塊均勻地平鋪瓶底，置CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(5)培養(yǎng)至第3d補充原代增補培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至第5d補充原代增補培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，至第7d全換液，至細胞融合度達80%以上后，去舊培養(yǎng)基，用D-hanks液清洗細胞，加入重組胰酶溶液消化細胞，使細胞脫落，加入D-hanks液稀釋，離心，將細胞沉淀用原代增補培養(yǎng)基重懸，即得原代臍帶間充質干細胞；

其中，所述原代增補培養(yǎng)基是以DMEM-F12培養(yǎng)基為基質配制并包含：0.8%血小板裂解物、1%人血白蛋白、2μg/ml重組胰島素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF、0.1%硫代甘油、1%果糖。

2.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(3)中，將華通氏膠切割成0.25cm²大小的小塊。

3.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(4)中，按照規(guī)定組織量接種至培養(yǎng)瓶是指稱取步驟(3)所得華通氏膠組織塊1.5g接種至T225培養(yǎng)瓶。

4.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(4)中，每瓶添加15ml原代增補培養(yǎng)基，充分混勻，使組織塊均勻地平鋪瓶底，置CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(4)中，CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的條件為：5% CO₂，37℃，飽和濕度。

6.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(5)中，培養(yǎng)至第3d補充10ml原代增補培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

7.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(5)中，培養(yǎng)至第5d補充10ml原代增補培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

8.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(5)中，每瓶加5ml重組胰酶溶液消化細胞2min。

9.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(5)中，每瓶加入25ml的D-hanks液稀釋。

10.根據(jù)權利要求1的方法，其中步驟(5)中，以100xg離心10min。

11.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述D-Hanks液的組成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH₂PO₄、0.08g的Na₂HPO₄·12H₂O、0.35g的NaHCO₃、水至1000ml。