[發明專利]基于微流控芯片的單分子計數生物大分子計量方法

有效

• 申請號: 202011378175.8
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112457969B
• 公開（公告）日: 2022-05-27
• 發明（設計）人: 高運華;王迪;王志棟;沈海瀅;牛春艷;楊佳怡;吳梟
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12M1/36;C12M1/00;B01L3/00;C12Q1/68;G16B40/10
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開了一種用于生物大分子的單分子計數系統，主要由壓力泵、微流控芯片、引流導管、核酸存儲池和鞘液存儲池、流量調節裝置、熒光檢測裝置以及數據處理裝置組成。本發明還公開了基于所述系統的生物大分子單分子計數的計量方法，該方法包括：樣本制備、上樣、單分子熒光信號檢測與計數等步驟，對單個生物大分子進行檢測，無需PCR擴增，避免了可能因PCR污染造成定量結果偏高，或定性出現“假陽性”的情況；且減小實驗測量偏差，測量結果可直接溯源到SI單位(摩爾)。同時也節省了檢測時間，降低了試劑耗材成本。

技術領域

本發明涉及一種基于微流控芯片的單分子計數核酸計量方法，屬于計量科學領域。

背景技術

計量是利用技術和法制手段實現單位統一和量值準確可靠的測量活動，計量基準方法是具有最高計量學特性的測量方法，其操作可以被完全地描述和理解，可以用SI單位完整地表述其不確定度。基準方法在量值源頭復現和量值溯源傳遞中都發揮了重要的作用，研究建立計量基準方法，完善量值溯源傳遞體系對保證測量結果準確可靠，具有重要意義。

隨著生物科學技術不斷取得突破性進展，生命科學研究已逐漸從定性科學發展為精準定量的科學。核酸不僅是生命的基本遺傳物質，同時在指導蛋白質生物合成的過程中也發揮著相當重要的作用，深刻影響著生命體的生長、發育、以及遺傳等各個過程。因此核酸含量的定量測量技術已廣泛應用于食品安全(如轉基因作物的核酸定量)、臨床診斷(如病毒負荷量和用藥指導)、法證科學(如死亡時間推斷)、以及分子生物學基礎科學研究(如細胞因子mRNA表達水平)等各個領域。尤其當前新冠病毒的“陰霾”籠罩全球，研究建立核酸計量基準方法，是維護大眾生命健康的重要技術保障，也是生物計量研究的重點。

核酸定量測量方法有多種，它們根據是否需要標準物質可分為相對測量方法和絕對測量方法兩類。常見的方法包括紫外分光光度法(UV)、電感耦合等離子體-發射光譜(ICP-OES)、實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)以及數字PCR等(傅博強，王晶，唐治玉，等.核酸定量測量技術研究進展[J]，中國計量，2013(03):82-85；Liang W,Xu L,Sui Z,etal.Quantification of plasmid DNA reference materials for Shiga toxin-producing Escherichia coli based on UV,HR-ICP-MS and digital PCR[J].Chem CentJ,2016,10(1):55；Brennan RG,Rabb SA,Holden MJ,et al.Potential PrimaryMeasurement Tool for the Quantification of DNA[J].Analytical Chemistry,2009,81(9):3414-3420；Kralik P,Ricchi M.A Basic Guide to Real Time PCR in MicrobialDiagnostics:Definitions,Parameters,and Everything[J].Front Microbiol,2017,8:108；Baker M.Digital PCR hits its stride[J].Nature Methods,2012,9(6):541-544.)。

紫外分光光度法(UV)通過260nm的紫外吸收值定量核酸的濃度，操作簡單方便，是目前對核酸濃度初步定量的常規方法。但其靈敏度較低，且如果溶液中含有具有紫外吸收的其他化合物，如丙酮、苯系化合物、蛋白質等雜質，都會造成核酸定量結果的不準確(李春，劉建濤，高運華，等.紫外分光光度法測定核酸含量的影響因素分析[J].化學試劑，2020，42(01):53-57；Sirajuddin M,Ali S,Badshah A.Drug-DNA interactions andtheir study by UV-Visible,fluorescence spectroscopies and cyclic voltametry[J].Journal of Photochemistry and Photobiology B,Biology,2013,124:1-19)。