[發(fā)明專利]一種篩選鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011377963.5
• 申請(qǐng)日: 2020-12-01
• 公開（公告）號(hào): CN112525978A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張輝;李春楠;王亞平;吳楠;杜延佳;李晶峰;李志成;邊學(xué)峰;呂金朋;蘭夢(mèng);高旭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林省東北亞生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N27/62
• 分類號(hào): G01N27/62
• 代理公司: 長(zhǎng)春市吉利專利事務(wù)所(普通合伙) 22206
• 代理人: 李曉莉

1.一種篩選鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分的方法，其特征是：包括以下步驟，并且以下步驟順次進(jìn)行，

步驟一、制備鹿茸鮮品以及鹿茸傳統(tǒng)加工品樣品；

步驟二、制備鹿茸鮮品凍干粉以及鹿茸傳統(tǒng)加工品樣品凍干粉；

步驟三、制備質(zhì)譜測(cè)定用的鹿茸鮮品濾液和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液；

步驟四、對(duì)鹿茸鮮品濾液和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液分別進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，獲得鹿茸鮮品濾液的一級(jí)質(zhì)譜指紋譜圖和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液的一級(jí)質(zhì)譜指紋譜圖，將各圖譜導(dǎo)出，獲得鹿茸鮮品濾液的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、鹿茸鮮品濾液的離子峰二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液的離子峰二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)；

步驟五、分離培養(yǎng)活性測(cè)定用的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞；

步驟六、利用小鼠睪酮(T)試劑盒和顯色后的吸光值分別測(cè)定鹿茸鮮品濾液和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液促進(jìn)大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌量；

步驟七、將所述步驟四獲得的鹿茸鮮品濾液的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、鹿茸鮮品濾液的離子峰二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液的離子峰二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Excell表格整理并導(dǎo)入Simca-p14軟件通過多元統(tǒng)計(jì)分析法獲得鹿茸促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的潛在活性成分，并結(jié)合鹿茸鮮品濾液的離子峰二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液的離子峰二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)獲得鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分結(jié)構(gòu)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分的方法，其特征是：所述步驟一中制備鹿茸鮮品以及鹿茸傳統(tǒng)加工品樣品的方法為：

將新鮮鹿茸用酒精燈火燎，去除絨毛，切成2份，1份使用保鮮膜將其斷面包裹，用于制備傳統(tǒng)加工品樣品，1份作為鮮鹿茸樣品，

將包裹好的鹿茸放入沸水中煮炸4次～8次，每次1min～3min，每次煮炸后用連有氮?dú)獾?6號(hào)針頭對(duì)茸尖端進(jìn)行排血，最后一次煮炸排血后放入50℃～90℃的烘箱中烘烤6h～10h，取出切成小塊，水洗4次～6次，保存于4℃的恒溫冰箱中作為傳統(tǒng)加工品備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分的方法，其特征是：所述步驟二中制備鹿茸鮮品凍干粉以及鹿茸傳統(tǒng)加工品樣品凍干粉的方法為：

分別取步驟一所得的鹿茸鮮品以及鹿茸傳統(tǒng)加工品樣品各10g～30g，分別以鹿茸樣品質(zhì)量10倍～20倍量的水進(jìn)行組織粉碎，在4℃下浸提24h～36h，轉(zhuǎn)速為3600r/min離心10min～30min后，取上清液進(jìn)行微濾，將微濾液凍干，分別獲得鹿茸鮮品凍干粉和鹿茸傳統(tǒng)加工品凍干粉。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分的方法，其特征是：所述步驟三中制備質(zhì)譜測(cè)定用的鹿茸鮮品濾液和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液的方法為：

取步驟二中鹿茸鮮品凍干粉和鹿茸傳統(tǒng)加工品凍干粉各1mg，分別以質(zhì)量濃度60％～80％的甲醇溶解并定容至1ml，轉(zhuǎn)速為12000r/min離心10min，取上清液，用0.45um的醇膜過濾，分別獲得質(zhì)譜測(cè)定用的鹿茸鮮品濾液和鹿茸傳統(tǒng)加工品濾液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分的方法，其特征是：所述步驟三中電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定使用的裝置在實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)經(jīng)過校正確定質(zhì)量范圍為m/z:200～500，采用正離子模式，由流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，流速為5μL/min，干燥氣溫度為350℃，干燥氣流量為9ml/min，霧化氣壓強(qiáng)為0.24Mpa(35.0psi)，毛細(xì)管電壓為3.5kV。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種篩選鹿茸促睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的活性成分的方法，其特征是：所述步驟五中分離培養(yǎng)活性測(cè)定用的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的方法為：

取體重為250g～300g的SD雄性成年大鼠的睪丸并隨機(jī)分組，分別放入Type I膠原酶中，35℃～38℃恒溫振蕩器中振蕩消化20min～40min，用2倍～4倍體積的DMEM培養(yǎng)基稀釋終止消化，過濾、離心后制成懸浮液，將各懸浮液吸出后分別接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃CO2孵箱中培養(yǎng)24h獲得實(shí)驗(yàn)用睪丸間質(zhì)細(xì)胞懸液。