[發(fā)明專利]玉樹無鉤蝠蛾的實(shí)時熒光PCR檢測方法及檢測試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011377946.1
• 申請日: 2020-12-01
• 公開（公告）號: CN112322712B
• 公開（公告）日: 2021-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉靜遠(yuǎn);印麗萍;張寧;易建平
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 上海市匯業(yè)律師事務(wù)所 31325
• 代理人: 王函

本發(fā)明公開了一種冬蟲夏草寄主昆蟲玉樹無鉤蝠蛾的實(shí)時熒光PCR檢測方法及檢測試劑盒，根據(jù)玉樹無鉤蝠蛾的mtDNA中部分基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物YSF3/YSR3和探針YS?P3，建立了玉樹無鉤蝠蛾的實(shí)時熒光PCR檢測方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測鑒定玉樹無鉤蝠蛾，并用于在多種冬蟲夏草寄主昆蟲中準(zhǔn)確區(qū)分玉樹無鉤蝠蛾的目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及中藥材和植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種玉樹無鉤蝠蛾的實(shí)時熒光PCR檢測方法；此外，本發(fā)明還涉及用于實(shí)時熒光PCR檢測玉樹無鉤蝠蛾的試劑盒。

背景技術(shù)

玉樹無鉤蝠蛾Ahamus yushuensis（Chu et Wang，1985），隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）蝙蝠蛾科（Hepialidae）無鉤蝠蛾屬（Ahamus），是冬蟲夏草寄主昆蟲，冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，被收錄入我國藥典，被稱為“中藥三寶”之一，在我國僅在青藏高原的西藏、青海、四川、云南、甘肅五省部分地區(qū)有分布。同時，冬蟲夏草寄主昆蟲具有明顯的種類地域分布特征，通常一個產(chǎn)區(qū)的冬蟲夏草寄主昆蟲為一種昆蟲，僅有少數(shù)優(yōu)勢種類在多個冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)有分布。在中藥材領(lǐng)域，不同地區(qū)的冬蟲夏草品級相差較大，玉樹無鉤蝠蛾是冬蟲夏草寄主昆蟲的優(yōu)勢種，真菌寄生在玉樹無鉤蝠蛾上而產(chǎn)的冬蟲夏草質(zhì)量較好，該蟲在四川甘孜州康定縣、青海玉樹州有分布。因此，區(qū)分冬蟲夏草的寄主昆蟲，能有效的區(qū)分冬蟲夏草的品級，因此建立不同寄主昆蟲冬蟲夏草的快速準(zhǔn)確鑒定方法十分必要。

中國發(fā)明專利申請CN201210506713公開了一種冬蟲夏草原草粉的雙重PCR鑒真方法，其運(yùn)用冬蟲夏草菌和冬蟲夏草寄主昆蟲通用引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增的鑒別冬蟲夏草原粉，與本專利申請目標(biāo)和方法不同，無法進(jìn)行冬蟲夏草寄主昆蟲檢測。

中國發(fā)明專利申請CN201711340871公開了冬蟲夏草菌培養(yǎng)液中蝙蝠蛾擬青霉的檢測引物組、檢測試劑盒和檢測方法，其通過常規(guī)PCR反應(yīng)檢測冬蟲夏草菌培養(yǎng)液中蝙蝠蛾擬青霉的攜帶情況的方法，用于檢測冬蟲夏草菌培養(yǎng)液，與本專利申請目標(biāo)和方法不同。

中國發(fā)明專利申請CN201210034612公開了一種鑒別冬蟲夏草的線粒體基因序列和方法，通過設(shè)計(jì)冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾科特異性引物以區(qū)別冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾科與其它鱗翅目昆蟲，用于鑒別冬蟲夏草真?zhèn)?，根?jù)最新冬蟲夏草寄主昆蟲研究進(jìn)展，冬蟲夏草寄主昆蟲分類地位變化，冬蟲夏草寄主昆蟲主要集中在蝙蝠蛾科現(xiàn)鉤蝠蛾屬(Thitarodes)、無鉤蝠蛾屬( Ahamus) 和蝠蛾屬( Hepialus)(鄒志文等,2010;邱乙等,2015)。該專利中將是否為蝙蝠蛾科昆蟲作為鑒定冬蟲夏草真?zhèn)蔚臉?biāo)準(zhǔn)已不符合實(shí)際情況。另外，其目標(biāo)與方法與本專利申請不同。

中國發(fā)明專利申請CN201910910660公開了熒光定量PCR檢測粉擬青霉菌的引物和探針，其針對人工培育冬蟲夏草夏草過程中出現(xiàn)的寄主昆蟲致死菌-粉擬青霉菌的實(shí)時熒光檢測方法，檢測目標(biāo)與本專利申請檢測目標(biāo)不同。

中國發(fā)明專利申請CN202010148471.2公開了小金蝠蛾的實(shí)時熒光PCR檢測方法及檢測用引物和探針，其檢測目標(biāo)與本專利申請檢測目標(biāo)不同。小金蝠蛾分布局限，研究深入，其線粒體全序列在NCBI上已有發(fā)布，可在線粒體基因全序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)其引物探針。而玉樹無鉤蝠蛾同為冬蟲夏草優(yōu)勢寄主昆蟲，但是其近似種較多，其線粒體基因全序列尚不明確，這給研究玉樹無鉤蝠蛾的實(shí)時熒光PCR檢測方法帶來了更大的技術(shù)困難。

目前沒有冬蟲夏草寄主昆蟲玉樹無鉤蝠蛾的實(shí)時熒光鑒定相關(guān)的專利文獻(xiàn)和非專利文獻(xiàn)公開。

本發(fā)明針對名貴中藥冬蟲夏草的寄主昆蟲進(jìn)行鑒定區(qū)分。中藥材冬蟲夏草為冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科Hepialidae昆蟲幼蟲上以后形成的僵蟲和菌子實(shí)體的干燥體，無法在形態(tài)上區(qū)分冬蟲夏草的寄主昆蟲，且冬蟲夏草寄主昆蟲種類繁多，地理分布較近的種類分子水平的差異也較小，這對實(shí)時熒光特異性Taqman探針的設(shè)計(jì)造成一定難度，是本領(lǐng)域的技術(shù)難題。因此，本領(lǐng)域亟需解決這一技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容