[發(fā)明專(zhuān)利]一種生產(chǎn)長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011374947.0
• 申請(qǐng)日: 2020-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112410315B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓瑞枝;柴寶成;姜鈺琳;倪曄
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/44;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的方法，屬于酶工程以及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的方法，此方法中利用了環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體S77N、Y195S、Y195I、S77N、S77N/Y195S以及S77N/Y195I，使得長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷含量顯著提升，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，將反應(yīng)液中長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的含量提高至9.8g/L，將反應(yīng)液中長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的含量占反應(yīng)液中總糖基化槐角苷含量的比例提高至45％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的方法，屬于酶工程以及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

槐角苷，豆科植物槐樹(shù)果實(shí)，廣泛分布于自然界中，主要存在于大豆、綠豆、苜蓿、燕麥、大麥、黑麥、小麥、玉米等谷類(lèi)植物中，是一種具有弱雌激素樣作用的非雌激素類(lèi)化合物，在醫(yī)藥以及保健等領(lǐng)域均具有極高的應(yīng)用前景。

現(xiàn)代藥理研究表明，槐角苷對(duì)慢性肝炎病人的降谷丙轉(zhuǎn)氨酶效果良好，還能同時(shí)抑制由巴豆油誘導(dǎo)的耳水腫和角叉菜膠引起的爪水腫。臨床研究也證實(shí)，槐角苷可用于防治婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的癥狀。槐角浸羔注射于家兔，能使血糖一時(shí)性增高。據(jù)南京藥物研究所報(bào)道，從槐角中提出的染料木素和山柰酚，具有干擾孕卵運(yùn)輸、終止孕卵著床和抗早期妊娠等作用，可能與其雌性激素活性有關(guān)；小量長(zhǎng)期服用染料木素和槐角甙，對(duì)雌性小鼠在不影響交配率和生長(zhǎng)的情Chemicalbook況下，有顯著的抗生育作用。毒性作用，槐角浸羔能使家兔及豚鼠的紅細(xì)胞減少，尤以莢果作用為大。槐樹(shù)種子提取液能使兔、豬、人的紅細(xì)胞凝集，種子、莢、果肉均含有抗A、抗B、抗H凝集素；中國(guó)槐為含有植物血凝素類(lèi)藥物，并具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用。有研究表明，二葡萄糖基槐角苷和三葡萄糖基槐角苷在水中的溶解度更高。也有研究表明，將槐角苷進(jìn)行糖基化并不影響其生理生化功能。并且，有研究表明，糖基化槐角苷在體內(nèi)會(huì)水解為可被人體吸收的葡萄糖與染料木素，安全性較高。因此，可通過(guò)將槐角苷進(jìn)行糖基化以提高其水溶性。

前期實(shí)驗(yàn)表明，以二葡萄糖基染料木素槐角苷為底物更能提高糖基化效率，所以將槐角苷直接作為底物。

環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，簡(jiǎn)稱(chēng)CGTase或CGT酶，EC2.4.1.19)是常見(jiàn)的可催化糖基化反應(yīng)的酶，可使用此酶對(duì)槐角苷進(jìn)行糖基化。

但是，現(xiàn)有的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶合成長(zhǎng)鏈槐角苷的效率較低，合成短鏈糖基槐角苷的效率較高，這大大限制了利用環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶合成長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的產(chǎn)量。因此，急需找到一種產(chǎn)量高的生產(chǎn)長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的方法。

發(fā)明內(nèi)容

[技術(shù)問(wèn)題]

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種產(chǎn)量高的生產(chǎn)長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的方法。

[技術(shù)方案]

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷的方法，所述方法利用了環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，在麥芽糊精的體系中，對(duì)槐角苷進(jìn)行催化，制備得到長(zhǎng)鏈糖基化槐角苷。

本發(fā)明提供了環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，其特征在于，以氨基酸序列如SEQID NO.2所示的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶為親本，將親本第77位和/或第195位突變，所示突變體為如下(a)～(e)任一：

(a)將親本第77位突變?yōu)樘於０罚?/p>

(b)將親本第195位突變?yōu)榻z氨酸；

(c)將親本第195位突變?yōu)楫惲涟彼幔?/p>

(d)將親本第77位突變?yōu)樘於０罚⒂H本第195位突變?yōu)榻z氨酸；

(e)將親本第77位突變?yōu)樘於０罚⒂H本第195位突變?yōu)楫惲涟彼帷?/p>

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼親本的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。