[發明專利]寧鄉曬煙的DNA指紋圖譜及其應用

有效

• 申請號: 202011374230.6
• 申請日: 2020-04-27
• 公開（公告）號: CN112501334B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 劉楠;張威;何聲寶;王英元;羅安娜;馮曉民;張曉慧;范月月
• 申請（專利權）人: 國家煙草質量監督檢驗中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京瑞恒信達知識產權代理事務所(普通合伙) 11382
• 代理人: 張偉

本發明公開了煙草品種的DNA指紋圖譜庫，所述DNA指紋圖譜庫包括101個特異性SNP位點；并且本發明還提供了采用所述DNA指紋圖譜庫在煙草品種鑒定中的應用。本發明提供的DNA指紋圖譜庫以及特定煙草品種的DNA指紋圖譜基于簡化基因組測序得到，用于煙草品種鑒定時，與傳統的外觀、評吸鑒定方法相比，可以提供更加客觀、更加準確、更加可靠的鑒定結果。

技術領域

本發明涉及分子生物學研究領域，具體而言，本發明涉及煙草品種的DNA指紋圖譜庫及其在煙草品種鑒定中的應用。

背景技術

為了依法處理煙草原料的走私和違法銷售，需要對依法罰沒的煙草原料進行鑒別檢驗。目前在煙草原料的鑒別檢驗工作中，煙葉狀的樣品基本上是通過外觀、評吸等主觀手段進行。

為了提升鑒別檢驗的準確性，已經進行了煙草DNA鑒別檢驗的研究。由于在DNA分子水平，不同物種間甚至是同一物種不同個體之間都能得到很好的區分，因此DNA分子技術作為物種分類鑒定的一種手段，已被廣泛地應用于屬間、種間、品種間的分類鑒定和親緣關系研究中，幾乎可以對所有的生物種類進行分類鑒定，在目前物種鑒定技術中發展最快，也最為熱門。

目前DNA分子鑒定技術已有數十種之多，如限制性片段長度多態性標記、隨機擴增多態性標記、序列特異性擴增區域標記、內含子長度多態性標記、單核苷酸多態性、簡單序列重復標記等。目前用于煙草鑒定的DNA分子技術主要就是SSR標記技術和SNP標記技術。

SSR標記技術是目前應用最為廣泛的DNA分子鑒定方法，但是由于SSR標記所承載的遺傳信息有限，以SSR標記來進行鑒定，為了保障鑒定結果的可靠性，往往需要設計多達十幾到二十多對的引物，引物的設計開發比較復雜，并需要大量的驗證試驗，這就造成前期引物設計周期長，實驗驗證工作量大，后期鑒定時操作比較繁瑣，鑒定通量低，并且在稍復雜的鑒定中，還是需要測序來驗證檢驗結果的準確性。SNP標記技術包括質譜法、芯片法等，質譜法所采用的質譜設備昂貴且檢測通量低，芯片法成本較高，且需要進行基因芯片的定制，實驗操作比較復雜。

受益于當前測序技術的進步和成本的大幅度降低，以測序法進行煙草DNA鑒定成為可能。測序法主要包括簡化基因組測序法和全基因組重測序法，這兩種方法都能夠比較全面的獲取被檢樣品的遺傳信息，區別在于簡化基因組測序所需要的位點數較少，覆蓋基因組的5％-10％即可，而全基因組重測序則需要獲得整個基因組的遺傳變異信息，需要的數據量大，成本高，結合煙草DNA鑒定的實際情況，簡化基因組測序已經完全可以滿足鑒定要求。

開發煙草品種的新型DNA鑒定方法對于提升相關品種鑒定的準確性、對于推動煙草DNA鑒別檢驗工作的發展具有積極的意義。

發明內容

針對上述技術問題，本發明的目的是提供一種可用于鑒定煙草品種的DNA指紋圖譜庫，所述DNA指紋圖譜庫包括品種特異性的SNP位點。此外，中國煙草的兩大類型為晾曬煙和烤煙，前者以寧鄉曬煙為典型品種，后者以中煙103和云煙87為典型品種。在實際鑒定工作中這幾類煙草的鑒定需求大，鑒定難度高，因此本發明的目的還在于提供這些特定煙草品種的DNA指紋圖譜。

本發明的技術方案如下。

一方面，本發明提供一種煙草品種的DNA指紋圖譜庫，所述DNA指紋圖譜庫包括如下101個特異性SNP位點：

另一方面，本發明還提供所述指紋圖譜庫的建立方法，包括以下步驟：

(1)收集煙草品種種質共131個，見表1，取新鮮煙葉分別提取基因組DNA，然后以限制性內切酶SacI和MseI分別對基因組DNA進行酶切；