[發明專利]一種糖原累積?、馼型基因點突變小鼠模型的構建方法及應用

在審

• 申請號: 202011373958.7
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112889754A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 邵詠賢;劉麗;徐佳南;梁翠麗
• 申請（專利權）人: 廣州市婦女兒童醫療中心（廣州市婦幼保健院;廣州市兒童醫院;廣州市婦嬰醫院;廣州市婦幼保健計劃生育服務中心）
• 主分類號: A01K67/027
• 分類號: A01K67/027;C12N15/85;C12N15/55;C12N15/12;C12N15/10;A61K49/00
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 張金銘

1.一種糖原累積病Ⅰb型基因點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于，所述的構建方法包括使SLC37A4基因點突變的雜合子小鼠與其他品系的野生型小鼠進行雜交，篩選F1代中雜合子突變小鼠，再經過F1代自交篩選得到F2代中SLC37A4基因點突變純合子突變小鼠。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述SLC37A4基因點突變使SLC37A4基因編碼的蛋白質p.Gly149Glu氨基酸序列發生點突變；

優選地，所述蛋白質p.Gly149Glu氨基酸序列發生點突變包括，第149位的甘氨酸突變為谷氨酸、第28位精氨酸突變為半胱氨酸、第115位甘氨酸突變為精氨酸或第191位脯氨酸突變為亮氨酸。

3.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述SLC37A4基因點突變包括SLC37A4基因第446位核苷酸由G突變為A，點突變后SLC37A4基因核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，或者所述點突變包括SLC37A4基因第446位核苷酸由G突變為A的同時，同時第447位核苷酸由A突變為G。

4.權利要求1-3任一項所述的構建方法，其特征在于，通過基因編輯方法獲得SLC37A4基因點突變的雜合子小鼠。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述基因編輯方法包括，采用CRISPR-Cas9方法得到SLC37A4基因點突變的雜合子小鼠。

6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，所述的CRISPR-Cas9方法包括，將載有編碼Cas9 mRNA和sgRNA的DNA序列的載體，與SLC37A4基因點突變donor oligo序列注射入小鼠受精卵后移植代孕，篩選生產出的小鼠得到SLC37A4基因點突變的雜合子小鼠；

優選地，所述Cas9 mRNA序列包括SEQ ID No.3所示序列；

優選地，所述donor oligo序列包括SEQ ID No.4所示序列；

優選地，通過基因測序的方法進行篩選；

優選地，所述基因測序所使用的上游引物和下游引物分別包括SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示序列；

優選地，所述載體包括pRP[CRISPR]-hCas9-U6。

7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，所述的sgRNA序列為反向引導序列，包括SEQ ID No.7所示序列。

8.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于，所述的SLC37A4基因點突變的雜合子小鼠品系包括C57BL/6品系。

9.根據權利要求8所述的構建方法，其特征在于，所述的其他品系的野生型小鼠品系包括C57BL/6或DBA/2；優選為DBA/2品系。

10.權利要求1-9任一項所述的構建方法得到的小鼠模型在由SLC37A4基因缺陷引起的糖原累積病Ⅰb型藥物開發中的應用。