[發明專利]一種高通量自動化的單細胞蛋白質組樣品處理方法

在審

• 申請號: 202011373166.X
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN114577955A
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 張麗華;賀映云;袁輝明;戴忠鵬;楊開廣;張玉奎
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/02;G01N30/24;G01N30/72;G01N15/14
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

本發明涉及一種自動化的高通量單細胞蛋白質組樣品處理方法，是一種在液相色譜?質譜(LC?MS)聯用分析之前進行高通量單細胞分選和單細胞蛋白質組原位樣品處理的集成化方法，具體流程為：首先通過細胞分選技術將單細胞分選至96孔板中，利用加熱?冷卻循環實現單細胞的裂解，然后在孔內進行原位樣品處理，加入質譜兼容的表面活性劑實現蛋白質的高效提取，最后通過機器人移液平臺在各個樣品孔中加入胰酶，并在高功率紫外燈光照下實現蛋白質的快速酶解。96孔板中的酶解產物直接通過納升液相色譜(Nano?LC)進樣器完成自動上樣。本發明的優點是將蛋白質組樣品處理和LC?MS分析的全流程實現了自動化，從而有效避免人工操作對單細胞分析結果造成的誤差和干擾。

技術領域

本發明涉及一種高通量自動化的單細胞蛋白質組學樣品處理方法，是一種結合高通量單細胞分選、原位單細胞蛋白質樣品處理、紫外輔助快速酶解以及全自動化上樣的方法，旨在提高單細胞蛋白質組樣品處理的回收率和分析通量。

背景技術

細胞是生命體最基本的功能單元。由于遺傳信息表達隨機性以及微環境變化等因素，細胞之間的異質性普遍存在，并在生物發育和疾病發展等過程中起著關鍵作用。基于群體細胞的常規分析反映的是平均值，往往會掩蓋細胞間的差異，因此需要在單細胞水平上研究細胞的異質性。然而，單細胞蛋白質組的規模化分析面臨著巨大挑戰：單個細胞的蛋白質含量極低，且無法像基因一樣進行擴增；同一細胞中存在多種類型的蛋白質及其修飾，其豐度差異往往跨越10個數量級；只有對大量單細胞中的多種蛋白質進行定量分析，才能提供足夠的數據發現復雜群體中的細胞異質性和功能特征，并揭示細胞間重要的相互作用。因此，單細胞蛋白質組學分析對靈敏度和通量有極高的要求。

目前，基于抗體的方法適合用于分析單細胞中感興趣的低豐度蛋白質，然而受抗體非特異性的限制。與抗體方法相比，質譜方法具有較深的定量覆蓋度，基于質譜的非靶向方法適合對單個細胞的蛋白質組進行全局分析，有利于發現未知的生物標志物或者揭示新的信號網絡。

傳統的群體細胞蛋白質組樣品處理方法通常需要微克至毫克的樣品起始量，處理流程包括蛋白質的提取、變性、還原、烷基化、脫鹽和酶解等，這些操作通常在離線條件下完成，并且需要多步轉移，因此會造成蛋白質樣品的損失，不適合用于痕量樣品如單細胞的分析。

近年來，單細胞蛋白質組樣品處理方法取得了較大的發展。通過采用微型化的反應裝置和自動化精密操作系統(Anal Chem,2018,90:5430-5438)、采取原位處理和機械裂解、將反應體積限制在納升等策略(Anal Chem,2018,90:14003-14010)，可以有效提高樣品回收率，為實現單細胞蛋白質組學的高靈敏質譜分析奠定了基礎。然而，目前單細胞蛋白質組分析缺乏一體化的樣品處理平臺和自動化LC上樣系統，不僅可能導致樣品在轉移過程中的損失，而且限制了單細胞蛋白質組學分析的通量。

針對當前單細胞樣品處理方法需要離線上樣、分析通量低等問題，我們發展了一種在LC-MS分析之前進行高通量單細胞分選、原位蛋白質組樣品處理以及無轉移直接上樣的集成化方法，該方法能夠實現全自動化的單細胞蛋白質組樣品處理及LC-MS分析。通過結合紫外輔助快速酶解，以進一步提高單細胞蛋白質組樣品處理的效率。

發明內容

本發明的目的在于提供一種全自動化單細胞蛋白質組學高通量樣品處理方法。通過結合高通量單細胞分選、原位單細胞蛋白質高效提取、紫外輔助快速酶解以及自動化上樣的方法，在提高單細胞蛋白質組分析通量的同時，避免樣品轉移導致的損失以及人工操作造成的干擾，從而提高樣品處理的回收率及分析結果的準確性。

為了實現該目的，本發明的技術方案是：

1、首先通過流式細胞熒光分選儀(FACS)將單細胞分選至PCR 96孔板中，每孔分選得到一個細胞，立即采用平板離心機將含有細胞的液滴甩至孔底，細胞分選后將96孔板密封防止液滴揮發，立即進行下一步樣品處理，或者置于-80℃冰箱保存。