[發明專利]一種引物探針組及其應用和一種檢測非洲豬瘟病毒和豬流行性腹瀉病毒的試劑盒

在審

• 申請號: 202011372195.4
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112391497A
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 于新友;王金良;沈志強;王海麗;胡紹良;孟衛芹;鄧鳳林;陳金龍;董林
• 申請（專利權）人: 山東綠都生物科技有限公司;深圳市康百得生物科技有限公司;山東省濱州畜牧獸醫研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

1.一種引物探針組，其特征在于，所述引物探針組包括針對非洲豬瘟病毒的特異性引物、非洲豬瘟病毒探針、針對豬流行性腹瀉病毒的特異性引物、豬流行性腹瀉病毒探針；

所述針對非洲豬瘟病毒的特異性引物包括上游引物和下游引物，所述針對非洲豬瘟病毒的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述針對非洲豬瘟病毒的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述針對豬流行性腹瀉病毒的特異性引物包括上游引物和下游引物，所述針對豬流行性腹瀉病毒的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述針對豬流行性腹瀉病毒的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述非洲豬瘟病毒探針為Taqman水解探針，探針序列如SEQ ID NO.5所示；所述豬流行性腹瀉病毒探針為Taqman水解探針，探針序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如權利要求1所述的引物探針組，其特征在于，所述非洲豬瘟病毒的特異性引物和非洲豬瘟病毒探針是針對非洲豬瘟病毒的VP72基因序列設計的；所述豬流行性腹瀉病毒的特異性引物和豬流行性腹瀉病毒探針是針對豬流行性腹瀉病毒的N基因序列設計的。

3.如權利要求1或2所述的引物探針組，其特征在于，所述非洲豬瘟病毒探針5’端標記有熒光報告基團FAM，3’端標記有熒光淬滅基團BHQ-1，所述豬流行性腹瀉病毒探針5’端標記有熒光報告基團HEX，3’端標記有熒光淬滅基團BHQ-1。

4.權利要求1～3任一項所述的引物探針組在制備檢測非洲豬瘟病毒和豬流行性腹瀉病毒的試劑盒中的應用。

5.一種基于雙重熒光PCR同時檢測非洲豬瘟病毒和豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1～3任一項所述的引物探針組。

6.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品、緩沖液和酶混合液。

7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品為含有SEQ ID NO.7或SEQID NO.8所示序列的pMD-18T混合質粒，所述陰性對照品為無核酸酶水，所述緩沖液為2×One Step RT-PCR Buffe，所述酶混合液為DNA聚合酶Ex Taq HS和反轉錄酶PrimeScriptRT Enzyme Mix酶的混合液。

8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶Ex Taq HS和反轉錄酶PrimeScript RT Enzyme Mix酶按照體積比0.8～1.2:0.8～1.2混合。

9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中的SEQ ID NO.1～4所示引物和SEQ ID NO.5～6所示探針的濃度分別獨立的為12～18pmol/μL，所述引物及探針的摩爾比為0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2；所述雙重熒光PCR擴增的反應程序為：42℃反轉錄5min；95℃預變性10s；95℃變性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s，共計38～45個循環。