[發(fā)明專利]一種檢測(cè)小鼠模型中人源CAR-T細(xì)胞拷貝數(shù)的引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011370482.1
• 申請(qǐng)日: 2020-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112322711A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 焦順昌;張嶸;梁皓;王雪薇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京鼎成肽源生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/686
• 分類號(hào): C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 董大媛

1.一種檢測(cè)小鼠模型中人源CAR-T細(xì)胞拷貝數(shù)的引物組，其特征在于，包括檢測(cè)CAR-T細(xì)胞目的基因的引物對(duì)和內(nèi)參基因的引物對(duì)；所述目的基因包括WPRE基因，所述內(nèi)參基因包括ABL基因；

檢測(cè)WPRE基因的引物對(duì)選自SEQ ID No.1～SEQ ID No.2、SEQ ID No.3～SEQ ID No.4和SEQ ID No.5～SEQ ID No.6中的一對(duì)；

檢測(cè)ABL基因的引物對(duì)為SEQ ID No.7～SEQ ID No.8或SEQ ID No.9～SEQ ID No.10。

2.一種檢測(cè)小鼠模型中人源CAR-T細(xì)胞拷貝數(shù)的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1中所述的引物組和熒光定量PCR反應(yīng)試劑。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述引物組包括SEQ ID No.1～SEQ IDNo.2所示的檢測(cè)WPRE基因的引物對(duì)和SEQ ID No.7～SEQ ID No.8所示的檢測(cè)ABL基因的引物對(duì)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述引物組中每一種引物的使用濃度為0.1μM～10μM。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR反應(yīng)試劑包括熒光定量PCRMix、DyeII和水。

6.一種檢測(cè)小鼠模型中人源CAR-T細(xì)胞拷貝數(shù)的方法，包括以下步驟：

1)將CAR-T細(xì)胞目的基因和內(nèi)參基因共同構(gòu)建到質(zhì)粒載體上獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；

2)提取小鼠外周血的全基因組DNA，并將所述全基因組DNA的濃度調(diào)節(jié)至25ng/μl獲得背景基因組，以所述背景基因組稀釋步驟1)中所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒獲得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；

3)提取回輸CAR-T細(xì)胞小鼠的外周血待測(cè)樣本的全基因組DNA，并將所述全基因組DNA的濃度調(diào)節(jié)至1～500ng/μl獲得待檢測(cè)DNA；

4)將步驟3)中所述的待檢測(cè)DNA、目的基因的引物組、內(nèi)參基因的引物組和熒光定量PCR反應(yīng)試劑混合獲得待測(cè)樣品熒光定量PCR反應(yīng)體系；

分別將步驟2)中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒與目的基因的引物組、內(nèi)參基因的引物組和熒光定量PCR反應(yīng)試劑混合獲得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熒光定量PCR反應(yīng)體系；

將所述待測(cè)樣品熒光定量PCR反應(yīng)體系、不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒熒光定量PCR反應(yīng)體系上機(jī)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)獲得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的內(nèi)參基因Ct值、目的基因Ct值、待測(cè)樣品的內(nèi)參基因Ct值和待測(cè)樣品目的基因的Ct值；

用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒目的基因Ct值與對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)的LOG值進(jìn)行線性擬合，獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒內(nèi)參基因Ct值與對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)的LOG值進(jìn)行線性擬合，獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

將待測(cè)樣品的目的基因Ct值和待測(cè)樣品內(nèi)參基因的Ct值分別帶入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得相應(yīng)的待測(cè)樣品中目的基因的拷貝數(shù)和人源CAR-T細(xì)胞的拷貝數(shù)；

所述步驟3)和步驟1)無(wú)時(shí)間順序限定。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)中以所述背景基因組稀釋標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，使標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)范圍在5copies～5×10⁶copies之間。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)的計(jì)算公式如下：拷貝數(shù)＝6.02×10²³×核酸濃度÷(DNA length×660)；所述拷貝數(shù)的單位為copies/ml，所述核酸濃度的單位為g/ml，所述DNA length為8399。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述待測(cè)樣品熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95℃30S，95℃5S，60℃34S。