[發明專利]一種河流弧菌4個O抗原血清型的環介導等溫擴增檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202011368066.8
• 申請日: 2020-11-30
• 公開（公告）號: CN112375835A
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發明（設計）人: 王磊;徐艷麗;黃敏;王敏;劉斌
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

本發明涉及一種對河流弧菌O抗原血清型分型的環介導等溫擴增（LAMP）檢測方法及應用。本發明以河流弧菌O1，O4，O14和O17的O抗原基因簇內的特異基因，即wzy為靶基因，設計并篩選了對河流弧菌O1，O4，O14和O17的O抗原血清型分型的各自4條LAMP引物，并建立了對應的檢測反應體系。利用本發明的LAMP方法檢測河流弧菌，并且對其進行O抗原分型，具有操作簡單、快速高效等優點。

技術領域

本發明涉及對河流弧菌O1，O4，O14和O17血清型菌株的環介導等溫擴增（LAMP）技術及其制備方法。本發明還涉及利用所述的LAMP技術進行檢測的方法。

背景技術

河流弧菌為革蘭氏陰性菌，是海洋環境的主要棲息菌之一，廣泛存在于河流和出?？诃h境水域，也是人類與水生生物主要的細菌性病原之一，可以起魚、蝦、貝等多種養殖動物的疾病，給養殖業帶來嚴重的經濟損失。河流弧菌還可以通過各種食物導致人類嚴重的流行性腹瀉，是弧菌屬中僅次于霍亂弧菌和副溶血弧菌的致病性弧菌，被認為是一種全球性的人獸共患的新型病原菌。

環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）能在等溫（60-65℃）條件下，短時間（通常是一小時內）內進行核酸擴增，是一種“簡便、快速、精確、低價”的基因擴增方法。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環等過程具有簡單、快速的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。

其技術原理為：60-65℃是雙鏈DNA復性及延伸的中間溫度，DNA在65℃左右處于動態平衡狀態。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶。使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環。

擴增分兩個階段：第1階段為起始階段，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。上游內部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補單鏈。FIP上的F1c與此單鏈上的F1為互補結構。自我堿基配對形成環狀結構。以此鏈為模板，下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結構的單鏈。迅速以3’末端的F1區段為起點。以自身為模板，進行DNA合成延伸形成莖環狀結構。該結構是LAMP基因擴增循環的起始結構。

第2階段是擴增循環階段。以莖環狀結構為模板，FIP與莖環的F2c區結合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。迅速以3’末端的B1區段為起點，以自身為模板，形成DNA合成延伸及鏈置換，形成長短不一的2條新莖環狀結構的DNA，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪的擴增，且產物DNA長度增加一倍。在反應體系中添加2條環狀引物LF和LB，它們也分別與莖環狀結構結合啟動鏈置換合成。周而復始，擴增的最后產物是具有不同個數莖環結構、不同長度DNA的混合物，且產物DNA為擴增靶序列的交替反向重復序列。

血清學檢測方法可有效區分一個種/屬中不同致病性的菌株，對于致病菌的鑒定和流行病學調查具有重要意義。同一細菌不同血清型的O抗原多樣性，是由于編碼合成O抗原的各種酶的基因的遺傳多樣性決定的，這些基因往往成簇地位于基因組上的固定位點，被稱作O抗原基因簇。前期研究中，我們發現，河流弧菌的O抗原基因簇信息已被破譯，這使得采用分子生物學方法，以基因簇中的特異基因為目標，實現對河流弧菌的分子血清學檢測成為可能。

發明內容

為實現上述目的，本發明公開了一種對河流弧菌O1，O4，O14和O17菌株進行O抗原血清型分型的LAMP引物，該引物含有FIP 引物、F3引物、BIP引物以及B3引物。其特征在于具有從河流弧菌O1，O4，O14和O17的wzy基因中分別選取得到的4個DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:16所示。