[發明專利]一種驗證水稻粒形和粒重的QTL的方法

在審

• 申請號: 202011367665.8
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112342311A
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 馮躍;李若思;魏興華;楊窯龍;袁筱萍;徐群;余漢勇;王一平;楊瑩瑩;李振;王珊;孫燕飛
• 申請（專利權）人: 中國水稻研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;A01H1/02;A01H1/04
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 趙浩竹

1.一種驗證水稻粒形和粒重的QTL的方法，其特征在于，包括以下驗證步驟：

步驟一：準備材料

滲入系IL188來源于粳稻品種日本晴和從國際水稻研究所(IRRI)種質資源中心收集的小粒野生稻W303之間的種間雜交，再以日本晴為輪回親本回交三代，并借助胚拯救技術，隨后自交四代，由母本IL188和父本日本晴之間雜交的F₁自交構建由166個株系組成的F₂群體，F_2:3群體來源于F₂各株系自交獲得；

步驟二：根據QTL分析的初步結果，利用分子標記從F_2:3群體中篩選4個剩余雜合體，順序雜合片段分布在RM500–RM429區間；自交構建4個NIL-F₂群體：共180株、184株、184株和195株，分別命名為R1、R2、R3和R4群體；

步驟三：從連續雜合區段為Y7-3–Y7-4的R3群體中進一步篩選4個單株；自交構建4個NIL-F₂群體：共有130株、144株、146株和140株，分別命名為R5、R6、R7和R8群體；然后在R6和R8群體中進一步鑒定非重組純合植株并進行自交，再建立兩組NILs，每組由20個IL188純合基因型株系和20個日本晴純合基因型株系組成；

步驟四：F₂和F_2:3群體于2014年夏、冬季分別在中國水稻研究所杭州試驗基地(N 30°32′，E 120°12′)和中國水稻研究所海南陵水試驗基地(N 18°48′，E 110°02′)種植；NIL-F₂群體和兩套NILs分別于2015年、2016年和2017年夏季在中國水稻研究所杭州實驗基地種植；F₂和NIL-F₂群體的植株間距為20cm，行間距為30cm；F_2:3群體和2套NILs采用完全隨機區組設計，重復兩次，每小區5行，每行8株，每行株間距20cm，行間距30cm；田間管理方式按照常規栽培要求實施；

步驟五：粒形性狀評價

對于F₂群體和NIL-F₂群體，單株收獲進行性狀評價，對于F_2:3群體、NILs-qGL7^Nip和NILs-qGL7^IL188，每個株系收獲10株進行性狀評價，并在每個群體中對5個粒形性狀進行評價；對于粒長、粒寬和粒厚，隨機選擇20粒飽滿的稻谷，用電子數顯游標卡尺單獨測量，并取20粒的平均值用于數據分析。千粒重通過從每個F₂單株隨機選擇200粒飽滿的籽粒稱重來進行評估；F_2:3群體、NIL-F₂群體和NIL的表型評價與上述F₂植株的表型評價相同；

步驟六：用掃描電鏡觀察NIL-qGL7^Nip和NIL-qGL7^IL188在成熟期的小穗

將樣品在FAA溶液中4℃固定24h，然后用乙醇分級脫水，用臨界點干燥法進行干燥，最后樣品在掃描電鏡下觀察，并應用image J軟件測定小穗表皮細胞大小；

步驟七：DNA提取和分子標記分析

采用CTAB法從新鮮葉片樣本中提取DNA，利用512個具有良好基因組覆蓋率的SSR標記來檢測親本W303和日本晴之間的多態性，其中分布在12條染色體上的185個標記在兩個親本之間具有多態性；再利用IL188和日本晴之間的30個多態性標記對F₂和F_2:3群體進行基因型分析，進一步利用16個SSR和InDel標記用于精細定位；

步驟八：連鎖圖譜的構建及數據分析

利用MAPMAKER/EXP version 3.0構建遺傳連鎖圖譜，利用Kosambi映射函數將重組頻率轉換為cM，使用Windows QTL Cartographer 2.5進行復合區間作圖分析，以LOD閾值為2.5檢測可能存在的QTL；并對QTL進行命名，利用t測驗比較IL188和日本晴以及NIL群體中兩個純合基因型之間的表型差異，采用SPSS軟件進行粒形性狀的相關分析。

步驟九：最后得出鑒定結果。

2.根據權利要求1所述的一種驗證水稻粒形和粒重的QTL的方法，其特征在于：在步驟六中，溶液配比為福爾馬林:冰醋酸:乙醇，體積比1:1:18。