[發明專利]穩定表達人轉鐵蛋白受體1細胞株的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202011367027.6
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112501124A
• 公開（公告）日: 2021-03-16
• 發明（設計）人: 韓照中;潘紅芽
• 申請（專利權）人: 領諾（上海）醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/85;C12Q1/02;G01N33/68;C12R1/91
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本發明公開了一種穩定表達人轉鐵蛋白受體1的細胞系及其在藥物篩選中的應用，本發明提供了該細胞株的構建方法及其應用實例，包括(1)將hTfR1基因插入真核表達載體；（2）將步驟1得到的載體導入到宿主細胞中，經過加壓篩選得到穩定表達hTfR1的細胞系；3）步驟2得到的細胞系用于藥物篩選。

技術領域

本發明涉及一種穩定表達人轉鐵蛋白受體1(TfR1)細胞株的制備方法及其在藥物篩選中的應用

背景技術

轉鐵蛋白(transferrin，Tf)是一類廣泛存在于脊椎動物體液及其細胞中的單體糖蛋白家族，主要在肝臟合成，半衰期8天，血清濃度200–300mg/dL。成熟的Tf由679個氨基酸組成，分子質量約80kDa。晶體結構顯示Tf的第1-336的氨基酸酸殘基構成它的N端結構域，第337-679殘基構成它的C端結構域。N端、C端結構域又由兩個大小相同的小亞基構成。小亞基間的間隙是Fe結合位點，每分子的轉鐵蛋白能攜帶2個三價鐵離子(Fe³+)。轉鐵蛋白與Fe³+的相互作用取決于pH，pH為7.4時，轉鐵蛋白與Fe³+高效結合，在酸性pH下兩者分離。

轉鐵蛋白受體(CD7l)是參與鐵的吸收和調節細胞生長的必需的蛋白。人體鐵通過Tf運輸，組織細胞通過Tf-TfR介導的內化過程實現鐵的吸收。TfR1是一種II型跨膜糖蛋白，通過兩個二硫鍵交聯而成同源二聚體(180kDa)。其單體(含760個氨基酸，分子量為90-95kDa)包含一個大的胞外C端區域(671個氨基酸)，一個單跨膜區域(包含28氨基酸)及一個短的N端胞內調節區域(包含61氨基酸)。C端區域是一個外功能區，它包含Tf的結合位點。外功能區包含3個N-糖基化位點及一個O-糖基化位點，這些位點的糖基化作用是TfR1功能所必需的。

在高通量篩選、評估與transferrin結合或者靶向TfR1的藥物(包括小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗體等)能否有效結合TfR1的過程中，需要使用一種快捷的transferrin-TfR1或藥物-TfR1結合的體外細胞模型。本發明建立了HEK293F-hTfR1細胞模型，便于做transferrin介導的或者靶向TfR1的藥物抗體或其它藥物分子有效結合TfR1的細胞篩選模型。

發明內容

本發明提供一種穩定表達人轉鐵蛋白受體1細胞株的制備方法及其應用。

本發明提供的穩定表達人轉鐵蛋白受體1細胞株的制備方法，具體步驟如下：

將人源轉鐵蛋白受體1基因克隆到真核表達載體。

該真核表達載體具有如下特點：人源轉鐵蛋白受體編碼基因TfR1與綠色熒光素基因(eGFP)處于同樣的轉錄調控原件的控制之下，可以在哺乳動物細胞中共表達。

該真核表達載體具備在真核細胞中驅動外源基因表達的所有轉錄、翻譯所需要的調控原件，包括啟動子promoter、增強子enhancer、轉錄起始區、polyA加工和轉錄終止信號，以及核糖體結合區、翻譯起始信號、翻譯終止信號等；使TfR1與eGFP處于同樣的轉錄、翻譯調控原件控制之下，即處于同一個轉錄本或mRNA。

上述表達載體中人源TfR1和eGFP編碼基因之間包含自剪切肽T2A序列，使其在同一開放讀碼框(ORF)中，由CMV啟動子及其基因轉錄調控元件驅動TfR1和eGFP共表達。翻譯后的多肽序列在T2A自剪切位點被切割成TfR1以及eGFP。TfR1通過二硫鍵的形式組成成熟的同源二聚體TfR1受體。

為了便于觀察轉染效率和基因在細胞中的表達，可在真核表達載體中加入可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因，如GFP。載體開放讀碼框示意圖如說明書附圖1所示：

將上述步驟中獲得的表達載體導入到宿主細胞中，經過篩選得到穩定表達且具有功能活性的人轉鐵蛋白受體1細胞株。