[發(fā)明專利]珊瑚菜的內(nèi)參基因PP2A及其篩選方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011358754.6
• 申請(qǐng)日: 2019-07-22
• 公開（公告）號(hào): CN112342310B
• 公開（公告）日: 2022-10-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李莉;周義峰;李乃偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇瑞途律師事務(wù)所 32346
• 代理人: 陳彬;蔣海軍

本發(fā)明公開了珊瑚菜的內(nèi)參基因及其篩選方法與應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及珊瑚菜的內(nèi)參基因及其引物，所述內(nèi)參基因?yàn)镻P2A；并提供了一種珊瑚菜內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選方法，填補(bǔ)了珊瑚菜研究領(lǐng)域中缺少合適的、通用的內(nèi)參基因的空白。

本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)；

原申請(qǐng)申請(qǐng)日：2019-07-22；

申請(qǐng)?zhí)枺篊N201910659220.8；

發(fā)明創(chuàng)造名稱：珊瑚菜的內(nèi)參基因及其篩選方法與應(yīng)用；

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說，涉及珊瑚菜的內(nèi)參基因、及其篩選方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

珊瑚菜，傘形科多年生，是我國傳統(tǒng)中藥材北沙參的基源植物。北沙參與人參、玄參、丹參、黨參并 稱為五參，有養(yǎng)陰清肺，益胃生津功效，主治肺熱陰虛燥咳，胃燥咽干口渴等癥，臨床和保健中常用，其 地上部嫩莖葉并可作為蔬菜食用，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大。

珊瑚菜自然生長(zhǎng)于沿海沙灘地帶，在我國沿海省份，如遼寧、江蘇、山東、浙江、福建、廣東以及海 南，歷史上均為珊瑚菜的道地藥材產(chǎn)區(qū)，是北沙參商品藥材的重要來源地。然而由于沿海開發(fā)等原因，珊 瑚菜的沿海道地產(chǎn)區(qū)范圍逐漸縮小，甚至消失；近年來，隨著我國沿海新圍墾土地的開發(fā)利用，為珊瑚菜 的沿海道地產(chǎn)區(qū)規(guī)模的恢復(fù)提供了空間和機(jī)遇，然而現(xiàn)有的珊瑚菜主栽種由于長(zhǎng)期內(nèi)陸栽培及人工選種， 導(dǎo)致耐鹽性不足，在沿海鹽堿地恢復(fù)種植難度極大，所以亟需進(jìn)行珊瑚菜耐鹽機(jī)制研究。

另外，由于珊瑚菜藥材道地性形成的機(jī)制尚未清晰，而其特定的沿海高鹽生存環(huán)境，或許是影響其藥 效成分積累和藥材道地性形成的重要原因，具體的影響機(jī)制有極大研究意義。要解決上述兩個(gè)問題，不可 避免地要對(duì)珊瑚菜的耐鹽機(jī)制、育種、活性成分的合成代謝機(jī)理等各個(gè)方面進(jìn)行研究，均需對(duì)珊瑚菜進(jìn)行 植物分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究。

基因表達(dá)分析是植物分子生物學(xué)領(lǐng)域研究中重要手段之一，其在深入對(duì)探尋植物相關(guān)基因和調(diào)控機(jī)理、 揭示植物奧妙等方面至關(guān)重要。在研究基因表達(dá)水平時(shí)，需要用到內(nèi)參基因作為參照，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative real time PCR,qRT-PCR)技術(shù)，為獲得更加準(zhǔn)確可信的結(jié)果，都需要內(nèi)參基因?qū)δ繕?biāo)基因的 表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化衡量。

在通過qRT-PCR分析基因相對(duì)定量表達(dá)時(shí)，為了消除不同樣品初始模板差異、反轉(zhuǎn)錄效率差異的影響， 需要引入穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)Ρ磉_(dá)結(jié)果進(jìn)行校正。內(nèi)參基因通常是各種持家基因，在細(xì)胞內(nèi)組成穩(wěn)定性表達(dá)， 有助于保持細(xì)胞的功能。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件：1)不存在假基因(Pseudogene)，以避免基 因DNA非特異性擴(kuò)增；2)高度或中度表達(dá)，排除低表達(dá)；3)穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織(如正 常細(xì)胞和癌細(xì)胞)，而且其表達(dá)量是近似的，無顯著性差別；4)表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無 關(guān)；5)其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；6)不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響。在植物中經(jīng)常用的如18S rRNA、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、肌動(dòng)蛋白(Actin)等作 為內(nèi)參基因。然而完美的內(nèi)參基因幾乎不存在，大多內(nèi)參基因在不同的環(huán)境條件、不同的發(fā)育階段和組織 器官中表達(dá)并不是恒定不變的，只能在一定的試驗(yàn)范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)，不同植物有最合適的內(nèi)參對(duì)照 基因而同一種植物不同組織之間內(nèi)參基因的穩(wěn)定性也存在差異。所以，如果盲目以一種基因作為任何試驗(yàn) 條件下的內(nèi)參基因則直接影響研究結(jié)果的可靠程度，甚至產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果，因此針對(duì)特定的試驗(yàn)條件和樣 品類型選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)于得到準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果至關(guān)重要。