[發明專利]卵囊型生物破壁劑組合物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011355601.6
• 申請日: 2020-11-27
• 公開（公告）號: CN112400864B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發明（設計）人: 王健君;趙立山;呂健勇
• 申請（專利權）人: 松山湖材料實驗室
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司 44218
• 代理人: 陳培瓊

本發明公開了一種卵囊型生物破壁劑組合物及其制備方法與應用，本發明卵囊型生物破壁劑組合物組份包括有丙二醇、胰酶、聚乙二醇、檸檬酸鈉、脯氨酸、海藻糖、重鉻酸鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、標準PBS緩沖液和注射用水，本發明卵囊型生物破壁劑組合物中的有效成份能與卵囊壁結構中的角質蛋白、糖蛋白、磷脂等主要成份相互作用并破壞其致密排列的剛性結構，使之形成允許冷凍保存材料通過的孔道結構，實現僅在輕度破壞卵囊壁結構的基礎上增加卵囊滲透性，從而增強卵囊內玻璃化能力和抑制結冰能力，減少冰晶損害，延長低溫保存時間，有效擴展了冷凍保存方案在含有卵囊的生物的領域的可應用性。

技術領域

本發明涉及低溫凍存技術領域，特別涉及一種卵囊型生物破壁劑組合物及其制備方法和應用。

背景技術

近年來，細胞、組織和器官的冷凍保存迅速發展，冷凍保存技術的突破將為再生醫學、胚胎干細胞治療、切片病理檢測、疫苗和細胞藥品等產品的保存等領域的發展提供強有力的理論和實驗支撐。脫離原生母系環境的活性物質如細胞等在保存過程中由于新陳代謝等生命活動，消耗細胞內自身養分，其活性不可避免的隨著保存時間延長而減弱，直至完全失活。極低的溫度，通常為77K(-196゜C，液氮的沸點)，通過有效減慢甚至停止細胞內新陳代謝等生命活動，可以延長細胞的壽命，實現細胞等物質的長久保存。

目前普遍采用玻璃化冷凍法，將細胞等生物材料置于玻璃化冷凍保存試劑中平衡后，直接投入到液氮中，使細胞內外液體迅速進入玻璃化狀態。玻璃化冷凍保存試劑通常含有較高濃度的DMSO、甘油等小分子物質，這些物質可通過細胞膜進入細胞內部，增強細胞內玻璃化能力，使細胞在快速降溫過程中直接進入玻璃態從而避免結冰對細胞產生的損傷。此外，除了玻璃化冷凍法，近年來逐漸發展出一套新的冷凍保存策略，即冷凍保存劑的主要成份由具有控冰蛋白結構和功能的仿生冷凍材料，該冷凍保存劑具有控制結冰、抑制冰晶重結晶、調控冰晶形貌和降低冰晶生長速率等作用，進入細胞后通過調控冰晶演化實現細胞等物質在低溫下長期保存。目前，已經實現冷凍保存的生物材料包括多種動物細胞和組織，例如血細胞、精子、卵細胞、胚胎、干細胞等，但是對于含有卵囊類活性生物的冷凍保存尚未取得顯著進展，其中的關鍵桎梏在于卵囊壁的致密結構阻止冷凍保存材料進入卵囊內部。

球蟲和隱孢子蟲是近年備受關注的含有卵囊發育階段的寄生原蟲，卵囊對其感染性發育至關重要。球蟲是一種能寄生在動物腸道上皮細胞內的原生動物，傳染性強，危害性大，嚴重威脅禽、畜生命健康。目前，采用球蟲疫苗是行之有效的防控辦法，克服了使用化學藥物成本高、用藥時間長、易產生抗藥性等弊端，具有一次免疫終身保護的優勢。要充分發揮雞球蟲疫苗的作用，關鍵環節之一在于保證疫苗儲存和運輸過程中的質量穩定性。我國已研發和生產出國際領先的雞球蟲早熟選育弱毒疫苗，但其推廣應用過程中均受到保存時效短和運輸困難的限制。雞球蟲疫苗的主要成份是若干種球蟲的孢子化卵囊，具有不耐低溫的特性，通常需在2～8℃保存和運輸，這導致保存期最多只有7個月，嚴重影響了疫苗的代際傳遞和大規模生產。

隱孢子蟲是一種體積小于球蟲的寄生原蟲，與球蟲相似，也用孢子化卵囊感染人和動物。它們廣泛存在多種脊椎動物體內，是一種僅次于輪狀病毒、能引起嚴重腹瀉的腸病原體。隱孢子蟲還是重要的機會致病性原蟲，在免疫功能正常的宿主體內處于隱性感染狀態，但當宿主免疫功能低下時，出現異常迅速增殖，引起危及生命的持續性腹瀉和消瘦。目前的抗寄生蟲藥物對免疫缺陷和營養不良的人基本無效，治療方法急需改進。因此對致病原蟲隱孢子蟲的研究十分迫切，但隱孢子蟲卵囊保存期短，加上由于缺乏合適的低溫保存方法，獲得具有遺傳特征的卵囊十分困難。目前，隱孢子蟲的實驗室菌株必須在活體動物(小鼠、小牛和仔豬)內保存，每隔6-8周進行傳代繁殖，這不僅是一個昂貴且耗時的過程，而且限制了卵囊在不同實驗室之間的共享和相關疫苗和治療方法效果評價。