[發(fā)明專利]豬圓環(huán)病毒2d型CAP蛋白及其在亞單位疫苗制備中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011347139.5
• 申請日: 2020-11-26
• 公開（公告）號: CN112501186B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉喜鳳;郭兆隆;楊施瑜;韓賢舟;鄭杰;馬寧寧
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江鼎持生物制品有限公司;北京鼎持生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/34
• 分類號: C12N15/34;C12N15/866;C12N7/01;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 北京金宏來專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11641
• 代理人: 左海明

本發(fā)明公開了豬圓環(huán)病毒2d型CAP蛋白以及用該序列編碼的CAP蛋白制備的亞單位疫苗及其應(yīng)用。本發(fā)明通過昆蟲細(xì)胞密碼子偏愛性優(yōu)化合成豬圓環(huán)病毒2d型的CAP序列，將該序列構(gòu)建到桿狀病毒表達(dá)載體pFastbac11上，通過桿粒制備，桿粒轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞，重組桿狀病毒收獲及H5細(xì)胞表達(dá)，獲得PCV2d的CAP抗原蛋白。該抗原與佐劑ISA206乳化配制成豬圓環(huán)CAP?2d亞單位疫苗。該疫苗免疫豬能產(chǎn)生較高的中和抗體，可抵抗10supgt;6/supgt;TCIDsubgt;50/subgt;/ml?PCV2d?HB強(qiáng)毒株攻擊。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬圓環(huán)病毒2d型CAP序列及用該序列編碼的CAP蛋白制備的亞單位疫苗及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine?circovirus?2,PCV2)的感染能夠引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaning?multisystemic?wasting?syndrome,PMWS)。該病多發(fā)生在5-12周齡的保育豬，臨床主要表現(xiàn)為呼吸困難、喘氣、皮膚蒼白及消瘦。2005年以前我國流行的毒株主要為PCV2a及PCV2b型，2005年以后PCV2b逐漸增多，導(dǎo)致更嚴(yán)重的PMWS，近年來PCV2d逐漸增多呈流行趨勢。

PCV2屬于單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組全長1767bp或者1768bp，其中ORF2?編碼大小為233-234個氨基酸病毒的核衣殼蛋白CAP，CAP蛋白是主要的免疫原性蛋白。昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Insect?Baculovirus?Expression?Vector?System，IBEVS)是一種高效的真核表達(dá)系統(tǒng)，能進(jìn)行蛋白質(zhì)的加工修飾，表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白接近，具有很強(qiáng)的生物活性。

目前，市場上PCV2的疫苗主要是針對PCV2a和PCV2b的亞單位疫苗和滅活疫苗，本發(fā)明利用分離的PCV2d毒株的CAP序列，利用IBEVS進(jìn)行表達(dá)；CAP-2d抗原與佐劑乳化制備成豬圓環(huán)CAP-2d亞單位疫苗，能夠抵抗目前流行的豬圓環(huán)PCV2d毒株的攻擊。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種豬圓環(huán)病毒2d型CAP蛋白，及用該CAP-2d蛋白制備亞單位疫苗及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒的2d型CAP蛋白，所述2d型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，編碼該Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明還設(shè)計了一種重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)移載體，所述轉(zhuǎn)移載體包含一個或多個編碼?2d型Cap蛋白的基因序列，所述基因序列按照昆蟲細(xì)胞密碼子偏愛性優(yōu)化合成?PCV2d-CAP-DC核苷酸序列，如SEQ?ID?NO.3所示。本發(fā)明通過將PCV2d-CAP-DC核苷酸序列與桿狀病毒表達(dá)載體pFastbac11連接，構(gòu)建能表達(dá)豬圓環(huán)病毒PCV2d毒株衣殼蛋白?CAP-2d的桿狀病毒表達(dá)載體pFastbac11-PCV2d-CAP-DC，該載體通過轉(zhuǎn)化DH10Bac制備重組桿粒，桿粒轉(zhuǎn)染SF9，收獲重組CAP-2d桿毒PCV2d-CAP-DC-rBV,該毒株的建議分類命名為核型多角體病毒Nucleopolyhedovirus?sp.,于2020年10月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏號為CGMCC?No.20712。

同時本發(fā)明設(shè)計了上述重組桿狀病毒的構(gòu)建方法，構(gòu)建方法包括以下步驟，

(1)人工合成一段基因序列PCV2d-CAP-DC，該序列根據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子偏愛性進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化合成的PCV2d-CAP-DC序列如SEQ?ID?NO.3所示；

(2)BamHI和XbaⅠ酶切上述PCV2d-CAP-DC序列和pFastbac11載體，回收酶切后的PCV2d-CAP-DC序列和pFastbac11載體片段，連接、轉(zhuǎn)化、克隆PCR并進(jìn)行測序驗證，構(gòu)建pFastbac11-PCV2d-CAP-DC表達(dá)載體；