[發(fā)明專利]基于四面體三腳架輔助的多發(fā)夾串級聯(lián)組裝構(gòu)建通用型電化學生物傳感器超靈敏檢測靶在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202011346179.8 | 申請日： | 2020-11-25 |
| 公開（公告）號： | CN112649479A | 公開（公告）日： | 2021-04-13 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 易鋼;黃玉麒;趙書慧;張文秀 | 申請（專利權(quán)）人： | 重慶醫(yī)科大學 |
| 主分類號： | G01N27/26 | 分類號： | G01N27/26;G01N27/30;G01N27/327;C12Q1/6825 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 400016*** | 國省代碼： | 重慶;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 基于 四面體 三腳架 輔助 多發(fā) 級聯(lián) 組裝 構(gòu)建 通用型 電化學 生物 傳感器 靈敏 檢測 | ||
1.基于構(gòu)建一種穩(wěn)定堅固的四面體三腳架輔助于多發(fā)夾串級聯(lián)組裝雜交反應(yīng)超靈敏的電化學生物傳感器優(yōu)于檢測核酸DNA和甲基化DNA，其方法技術(shù)都將進行在后詳細說明。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述“四面體三腳架”3條55堿基鏈和82堿基長鏈通過高溫變性穩(wěn)定形成，3條鏈5’端修飾巰基，合成后TECP還原于電極上穩(wěn)定修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述多發(fā)夾串級聯(lián)組裝的均勻溶液各單獨發(fā)夾通過高溫變性后置室溫過夜穩(wěn)定形成，序列有效設(shè)計為靶標存在時促發(fā)逐個發(fā)夾后形成多發(fā)夾級聯(lián)雜交鏈。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述四面體三腳架凸出頂端部分穩(wěn)定識別捕獲靶標，權(quán)利要求2所述發(fā)夾H1第一結(jié)構(gòu)域在靶標存在時被催化打開，兩者穩(wěn)定雜交后順利促發(fā)多發(fā)夾串級聯(lián)雜交反應(yīng)。
5.同時靶標和四面體凸出端含5’-CCGG-3’結(jié)合后在Hpa Ⅱ酶識別驗證DNA甲基化,靶標:5’-TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACCGCAGGCCGG AGCTGCCGAGCTTT-3’；四面體三腳架:5’-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTATTTAAAGCTCGGCAGCTCCGGCCTGCG-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述4發(fā)夾雜交鏈串聯(lián)組裝，各發(fā)夾各部分的堿基互補配對部分層層級聯(lián)反應(yīng)形成樹枝狀雜交鏈，穩(wěn)定于四面體支架，發(fā)夾H1:5’-GTAGAGATGCGGTGGTCCTTGAGAGAATTCTTAACGTCGCCTCATACTGTCTCAAGGACCACCGCAT-3’；
發(fā)夾H2:5’-TCTCAAGGACCACCGCATCTCTACATGCGGTGGTCCTTGAGACAGTATGCCTAGCAGAGTT-3’；
發(fā)夾H3:5’-TCGCCTCCTAGCAGAGTTACTTTGAAACTCTGCTAGGAGGCGACGTTAAGAATTC-3’；
發(fā)夾H4:5’-TCAAAGTAACTCTGCTAGGAGGCGAGAATTCTTAACGTCGCCTCCTAGCAGAGTT-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5，因RuHex的電活性，超靈敏吸附于負載面積很大的多分支串級聯(lián)雜交鏈上，穩(wěn)定2分鐘，無光照下檢測DPV響應(yīng)信號。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述電化學生物傳感器制備方法，技術(shù)如下：
(1)四面體四條S鏈在含30mM TCEP巰基還原劑的TM反應(yīng)緩沖液中放置1小時充分還原，后95℃ 5分鐘一步合成1μM四面體三腳架穩(wěn)定存在并于-4℃儲存待用，總體積100μL；
(2)在0.5 M H2SO4中活化電極直到15個可重復(fù)CV后進行下述實驗，掃描電壓設(shè)置范圍為-0.2V-1.6V；
(3)發(fā)夾干粉溶解后需各自95℃ 5分鐘后室溫過夜形成終濃度1μM發(fā)夾結(jié)構(gòu)，稀釋于雜交鏈緩沖液（SPSC）中，并混合儲存在-4℃，沒有靶DNA存在和相應(yīng)溫度條件時無法促發(fā)雜交鏈反應(yīng),SPSC緩沖液包含1 M NaCl 和50 mM NaH2PO4；
(4)0.05μm氧化鋁粉末少量超純水中溶解混勻后拋光布上打磨金電極5分鐘，分別超純水、乙醇、超純水超聲儀中超聲5分鐘，食人魚溶液以3:1的98% H2SO4和30% H2O2 活化電極15分鐘后可備用；
(5)10μL四面體0.5μM滴加電極上室溫修飾過夜反；
(6)6μL 1mM MCH 滴加4℃封閉電極半小時；
(7)10μL靶DNA在DNA結(jié)合緩沖液中稀釋（血清實驗在10%血清中）滴加后37℃反應(yīng)2小時，事先制備好的1μM發(fā)夾混合物滴加37℃反應(yīng)5小時，DNA結(jié)合緩沖包括0.1M PB, 1 MNaCl 和20mM MgCl2?6H2O，PB 緩沖液包括0.2 M Na2HPO4和0.2 M NaH2PO4；
滴加10μL靶甲基化DNA 2h反應(yīng)后加10μL一定酶活的HpaⅡ酶切37℃反應(yīng)2h，后多發(fā)夾串級聯(lián)組裝反應(yīng)；
在含有5mM(Fe(CN)6)3?/4?的0.1MKCl溶液中進行循環(huán)伏安(CV)和電化學阻抗譜(EIS)的表征；
(10)在相應(yīng)濃度RuHex的10 mM Tri-HCl工作液中檢測DPV，先穩(wěn)定2分鐘后開始檢測，無明燈條件下檢測。
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