[發明專利]一種基于滋養層細胞的臍血Treg細胞體外擴增方法及應用

有效

• 申請號: 202011346010.2
• 申請日: 2020-11-26
• 公開（公告）號: CN112458053B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 陳勇軍;劉少先
• 申請（專利權）人: 成都云測醫學生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;A61K35/17;A61P37/02;A61P37/06;A61P29/00;A61P19/02;A61P17/06;A61P1/00
• 代理公司: 北京中索知識產權代理有限公司 11640
• 代理人: 唐亭

本發明公開了一種基于滋養層細胞的臍血Treg細胞體外擴增方法及應用，具體技術方法為：首先采用臍帶華通氏膠間充質干細胞作為滋養層細胞誘導臍血單個核細胞中Treg細胞的初步增殖；然后通過磁珠分選得到較純的Treg細胞；最后使用優化擴增因子刺激Treg細胞快速擴增。本發明采用人AB血漿、IL?2、雷帕霉素、RARA激動劑和DNA甲基轉移酶抑制劑作為優化擴增因子，可以在2個星期內能夠制備數量較多、純度較高、活性較強的臍血Treg細胞。使用臍血作為Treg細胞擴增的原料，可以批量制備，并能夠減少因樣本個體差異導致的Treg細胞質量波動。臍血Treg細胞免疫原性低，可作為通用型細胞用于臨床研究，如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體涉及一種基于滋養層細胞的臍血Treg細胞體外擴增方法及應用。

背景技術

調節性T細胞（Regulatory T cells，Treg）是CD4⁺T細胞中的一類重要細胞亞群，Treg細胞在誘導機體免疫耐受、維持免疫環境穩態、防止自身免疫性疾病發生等方面有著不可忽視的作用。Shimon Sakaguchi團隊于1995年首次確定CD25（IL-2 receptor α-chain，IL-2RA）為Treg細胞的表面標志物，研究人員發現將去除CD4⁺CD25⁺亞群的淋巴細胞移植至裸鼠體內會引發多種自身免疫性疾病，而輸入CD4⁺CD25⁺Treg細胞則可抑制疾病的發生。同時，Treg細胞還特異性表達轉錄因子FoxP3，FoxP3對于Treg發育和功能具有重要的調控作用，該基因突變可致Treg細胞發育、分化障礙和功能異常。此外，由于人體中活化的CD4⁺T細胞也高表達CD25，因此，人們通常還會使用CD127作為補充標志以更準確的鑒定Treg細胞。

Treg細胞的免疫調節作用是通過細胞間直接接觸和旁分泌作用實現的，其靶細胞主要是效應T細胞（Effector T cells，Teff）和樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）。此外，也包括巨噬細胞、B細胞、NK細胞等。人體的免疫系統平衡正是由Treg細胞核Teff細胞來維持的，而一旦兩者之間的平衡被打破，則會導致多種疾病的發生。Treg細胞數量過多與腫瘤、感染疾病等密切相關，而Treg細胞數量不足則會導致自身免疫性疾病。研究表明，在多種自身免疫性疾病中均出現了Treg細胞數量的減少或功能的異常。對Treg細胞的數目和功能的干預，可能是治療多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的針對性靶點。

人機體內Treg的數量非常少，外周血Treg細胞僅占CD4⁺T淋巴細胞的5～10%，100mL外周血僅能分離純化到10⁶數量級的Treg細胞。目前常規的擴增方法需要較大的樣本體積（250～400 mL外周血）以及較長的擴增周期（3～4周）。擴增過程中還易出現FoxP3表達不穩定的情況，導致細胞活性降低，不利于臨床應用。同時由于自身免疫性疾病患者體內的Treg細胞數量和功能異常，非常不利于自體Treg細胞的體外擴增。

發明內容

本發明針對現有技術存在的問題提供了一種細胞擴增倍數高、抑制活性強的基于滋養層細胞的臍血Treg細胞體外擴增方法及應用。

本發明采用的技術方案是：

一種基于滋養層細胞的臍血Treg細胞體外擴增方法，包括以下步驟：

步驟1：從臍血中分離單個核細胞；

步驟2：采用培養基將單個核細胞密度調整至0.5×10⁶～2×10⁶ cells/mL，接種至培養瓶，添加CD3/CD28免疫磁珠、人AB血清和IL-2；

接種臍帶華通氏膠間充質干細胞，臍血單個細胞核數量：臍帶華通氏膠間充質干細胞的數量比為2：1～10：1；