[發明專利]柑橘黃化脈明病毒RT-RPA檢測的特異引物、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202011345080.6
• 申請日: 2020-11-26
• 公開（公告）號: CN112251543A
• 公開（公告）日: 2021-01-22
• 發明（設計）人: 宋震;周常勇;馬志敏;許建建
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 重慶雙馬智翔專利代理事務所(普通合伙) 50241
• 代理人: 顧曉玲

本發明公開了一種柑橘黃化脈明病毒RT?RPA檢測的特異引物組，所述特異引物組為CY1?F/R或者CY3?F/R或者CY5?F/R。還公開了含有所述特異引物組的檢測試劑盒，還包含探針CY1?Probe。還公開了一種柑橘黃化脈明病毒的RT?RPA檢測方法，包括如下步驟：1)提取待測樣品RNA；2)利用提取的樣品RNA進行RT?RPA反應，RT?RPA反應采用權利要求1中所述的特異引物或者權利要求2所述的試劑盒；3)RT?RPA反應完成后對反應產物進行檢測，檢測到目標擴增對象的即為陽性樣品。本發明檢測方法，靈敏度高、特異性強、反應快速、操作簡單、適用性好，可肉眼直接觀察結果，無需大型精密儀器。

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，具體涉及一種柑橘黃化脈明病毒RT-RPA檢測的特異引物、試劑盒和方法。

背景技術

柑橘黃脈病是由柑橘黃化脈明病毒(Citrusyellow vein clearing virus，CYVCV)引起的一種新發蟲傳病害。CYVCV能夠侵染絕大多數柑橘種類，檸檬和酸橙受感染后，葉片黃化、扭曲、明脈，葉脈背面呈水漬狀，造成大量減產，部分雜柑和溫州蜜柑受侵染后表現為葉片卷曲等癥狀，甜橙在實驗條件下也可表現脈明等癥狀。柑橘黃脈病于1988年首次在巴基斯坦發現，2003年Alshami通過電子顯微鏡觀察到了彎曲的絲狀病毒顆粒，并將其病原命名為柑橘黃化脈明病毒。2009年，我國首次在云南發現該病，隨后Zhou等人對中國11個主要柑橘種植省份檢測調查，發現該病在9個省份已廣泛分布。由于CYVCV可通過帶毒接穗遠距離傳播，并可通過蟲傳和污染農具等高效傳播，近幾年來該病流行呈加速態勢，嚴重威脅柑橘產業，尤其是檸檬產業發展。早期檢測和應用脫毒苗木是有效防止此病為害的重要方法，因此建立簡便快速、有效的CYVCV檢測方法能為柑橘黃脈病的防控提供重要的技術支持。

CYVCV屬于α線性病毒科(Alphaflexiviridae)印度柑橘病毒屬(Mandarivirus)的正義單鏈RNA病毒。CYVCV基因組由7529個核苷酸組成，包含6個開放閱讀框(Open readingframe，ORF)。CYVCV可通過嫁接、繡線菊蚜(A.spiraecola)和柑橘粉虱(Dialeurodescitri)等在柑橘之間傳播，還可以通過機械摩擦接種到莧色藜(C.amaranticolor)、昆諾藜(C.quinoa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)和豇豆(Vigna unguiculata)等草本植株。在以往CYVCV的檢測技術中，指示植物檢測法、電子顯微鏡檢測法、血清學檢測法和核酸分子檢測技術等大多都具有操作復雜、檢測時間長、需要復雜實驗儀器、對實驗操作者要求較高等一些問題。

逆轉錄重組酶聚合酶擴增(Reverse transcription-recombinase polymeraseamplification，RPA)是一種新型等溫核酸擴增技術，該技術的原理主要模仿T4噬菌體的核酸復制機制，依賴重組酶和單鏈結合蛋白和鏈置換聚合酶在恒溫條件下實現與模板的特異性識別和擴增，其目標產物可通過凝膠電泳或添加特異性探針通過試紙條呈現。由于具有快速、靈敏、操作簡便等特點，該技術現已廣泛應用多種動植物病害的檢測。目前，國內外尚未有利用RT-RPA對CYVCV進行檢測的報道。

發明內容

本發明的目的是針對上述問題，提供一種柑橘黃化脈明病毒RT-RPA檢測的特異引物、試劑盒和方法。

本發明為了實現其目的，采用的技術方案是：

一種柑橘黃化脈明病毒RT-RPA檢測的特異引物組，所述特異引物組為CY1-F/R或者CY3-F/R或者CY5-F/R，其核苷酸序列如下所示：

CY1-F：5’-GTCACTAACTCCATAGCTAACCCTAAACAGAC-3’，

CY1-R：5’-GTTGAGATCTTCGTTCGCTCCAATAATATCAG-3’，