[發明專利]一種轉化酶及其在產S-雌馬酚中的應用

有效

• 申請號: 202011344813.4
• 申請日: 2020-11-26
• 公開（公告）號: CN112442490B
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 胡云霏;尹業師;陳華海;曹林艷;李百元;張飛
• 申請（專利權）人: 湖南科技學院
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P17/06;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種轉化酶C1-2079在催化大豆苷元生成二氫大豆苷元中的應用，其特征在于所述應用為：以轉化酶C1-2079為催化劑，以大豆苷元為底物，以NADPH、NADH為輔酶，加入亞硫酸氫鈉、二硫蘇糖醇和苯甲基磺酰氟，以pH7.0的0.1M磷酸鉀緩沖液為反應介質構成反應體系，在37℃厭氧條件下反應2-4h后，得到含有二氫大豆苷元的轉化液；所述轉化酶C1-2079的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示；所述反應體系中，轉化酶C1-2079加入終濃度為40μg/ml，大豆苷元加入終濃度為20μg/ml，NADPH和NADH加入終濃度均為500μg/ml，亞硫酸氫鈉加入終濃度為0.5mg/ml，二硫蘇糖醇加入終濃度均為0.3mg/ml，苯甲基磺酰氟加入終濃度均為0.2mg/ml。

2.一種轉化酶C1-2079在催化二氫大豆苷元生成大豆苷元中的應用，其特征在于所述應用的方法為：以轉化酶C1-2079為催化劑，以二氫大豆苷元為底物，以pH 6.5的0.1M檸檬酸鹽緩沖液為反應介質構成反應體系，在37℃條件下反應2-4h后，得到含有大豆苷元的轉化液；所述轉化酶C1-2079的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示；所述反應體系中，轉化酶C1-2079加入終濃度為40μg/ml，二氫大豆苷元加入終濃度為20μg/ml。

3.一種轉化酶C1-2079在制備S-雌馬酚中的應用，其特征在于所述應用為：以含轉化酶C1-2079編碼基因、二氫大豆苷元外消旋酶DDRC編碼基因、二氫大豆苷元還原酶DHDR編碼基因、四氫大豆苷元還原酶THDR編碼基因的工程菌發酵培養液作為催化劑，以大豆苷元為底物，在37℃條件下靜置發酵6-8h，獲得含S-雌馬酚的反應液，分離純化，獲得S-雌馬酚，所述轉化酶C1-2079的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述大豆苷元加入終濃度為40μg/ml；所述催化劑中菌體OD₆₀₀為1.8。

5.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述催化劑按如下方法制備：將包含轉化酶C1-2079編碼基因、二氫大豆苷元外消旋酶DDRC編碼基因、二氫大豆苷元還原酶DHDR編碼基因、四氫大豆苷元還原酶THDR編碼基因的工程菌接種至含有100μg/ml氨芐抗性和100μg/ml鏈霉素抗性的LB培養基中，37℃、180rpm孵育；當細菌OD₆₀₀為0.6時，加入終濃度為0.2mM的IPTG，在16℃、120rpm條件下誘導表達16h，獲得發酵培養液。

6.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述工程菌按如下方法構建：(1)轉化酶C1-2079編碼基因、載體PETDute-1-L-DZNR-DDRC分別經NotI和AvrII限制性內切酶酶切后連接，構建質粒PETDute-1-C1-2079-DDRC；(2)將PETDute-1-C1-2079-DDRC質粒加入到含0.1M氯化鈣的大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞液中，冰浴30min，然后42℃熱沖擊90s，再冰浴2min，加入4倍體積的LB培養基，37℃，180rpm孵育1h；收集孵育后的菌泥涂布到含有100μg/ml氨芐抗性的LB平板中，37℃培養12-16h；(3)挑取長出來的單菌落，在含有100μg/ml氨芐抗性的LB培養基中，37℃、180rpm培養2-4h至細菌OD₆₀₀為0.1；取菌液，在5000rpm條件下離心獲得菌泥，將所獲得的菌泥用無菌0.1M的CaCl₂溶液洗滌三次，加入預冷的0.1M無菌CaCl₂溶液懸浮菌體，然后在冰浴條件下孵育2-4h；(4)將PCDFDute-L-DHDR-THDR質粒加入到步驟(3)冰浴后的菌液中，將步驟(2)中氨芐抗性改為100μg/ml氨芐和100μg/ml鏈霉素抗性，其他操作同步驟(2)，構建含PETDute-1-C1-2079-DDRC和PCDFDute-L-DHDR-THDR的重組大腸桿菌BL21(DE3)工程菌。