[發明專利]一種斑馬魚肌肉特異誘導型表達載體及應用

有效

• 申請號: 202011340788.2
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112430624B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 林帆;張俊源;歐俊杰;盛芊艾;周雨晴;黃澤寧
• 申請（專利權）人: 汕頭大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 彭妙玲;周增元

本發明生物學領域，具體涉及一種斑馬魚肌肉特異誘導型表達載體及應用，將第三代Tet?on系統的兩個重要組件(Tet3G及pTRE3G)及斑馬魚肌肉特異啟動子(pmylz2)構建在同一個載體中，目的基因只需克隆于pTRE3G下游MCS位點(MluI、NheI、PstI等)，實現多合一的功能，填補了斑馬魚肌肉組織特異的誘導型基因表達系統的空白，為與肌肉相關的發育、疾病以及營養品質調控等方面的研究提供實用的工具。

技術領域

本發明生物學領域，具體涉及一種斑馬魚肌肉特異誘導型表達載體及應用。

背景技術

斑馬魚由于具有體外受精、胚胎透明，發育周期短等特點，加上其基因背景清楚、與人類基因同源性高、基因操作方法成熟等優點，已成為了一種重要的模式生物，在基因功能、發育生物學、疾病及藥物篩選等研究領域具有廣泛的應用前景。基因過表達是研究斑馬魚基因功能的常用手段，然而傳統組成型的過表達(持續表達、無組織特異性)，不適宜用于研究基因在特定發育時期、特定組織中的作用，例如很多疾病往往是在個體發育后期由于基因表達調控的變化而導致的。因此，條件型(可誘導)、組織特異性的基因表達調控系統的開發非常有必要。

肌肉不僅是機體重要的組織結構，也是魚類主要的可食部分。利用斑馬魚模型研究肌肉組織中關鍵基因的表達調控，有助于深入了解肌肉發育、相關疾病以及開發魚類肌肉品質的調控策略。四環素(tetracycline，Tet)及其衍生物強力霉素(doxycycline,Dox)調控的基因表達系統(Tet-on/Tet-off)已廣泛應用于體外調控真核細胞的基因表達。在小鼠體內，利用Tet-on系統與組織特異啟動子結合，能夠實現組織特異性的基因誘導表達[1-2]。在斑馬魚中也有一些研究表明利用Tet-on系統與心臟、神經系統、肝臟特異啟動子結合，能夠有效誘導基因在這些組織中的表達[3-5]。然而，目前斑馬魚肌肉組織特異誘導型的基因表達系統尚未見報道。此外，已有的斑馬魚組織特異性誘導型基因表達系統多由雙載體系統構成(包括：1.組織特異啟動子驅動的反義Tet轉錄活化因子(reversetetracycline?transcriptional?activator，rtTA)載體；2.Tet響應元件驅動(Tet-responsive?element,TRE)的目的基因載體)。這種雙載體系統可以通過受精卵共注射質粒篩選雙載體轉基因后代，或者單質粒注射分別篩選單轉基因后代，再進行雜交從而獲得雙載體轉基因后代。然而，由于雙載體的性質，這些后續的篩選工作仍較為繁瑣。

發明內容

本發明的目的在于，結合斑馬魚肌肉特異啟動子(骨骼肌肌球蛋白輕鏈2啟動子，myosin?light?polypeptide?2promoter,pmylz2)、第三代Tet-on系統(Tet3G+pTRE3G)以及Sleepy?Beauty轉座子骨架載體(pT2/BH)，構建斑馬魚肌肉特異Tet誘導型的單載體基因表達系統(MI-One)，從而簡化后續轉基因后代篩選流程，實現斑馬魚肌肉組織特異、高效的基因表達調控。

為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一種斑馬魚肌肉特異誘導型表達載體，其特征在于，所述載體同時具有Tet應答元件和反義Tet轉錄活化因子。

本發明利用肌肉特異啟動子誘導Tet轉錄活化因子，并將Tet應答件構建在同一載體上，構建在同一載體上提高了篩選組織特異誘導所需各元件的轉基因后代的效率，不需要進行單載體轉基因個體的雜交。

優選的，所述載體包括所述Tet應答元件、所述反義Tet轉錄活化因子、熒光蛋白標簽基因、斑馬魚肌肉特異啟動子和Sleepy?Beauty轉座子骨架。

優選的，所述Tet應答元件為pTRE3G；所述反義Tet轉錄活化因子為Tet3G；所述熒光蛋白標簽基因為EGFP，序列如SEQ.ID.NO.3所示；所述斑馬魚肌肉特異啟動子為骨骼肌肌球蛋白輕鏈2啟動子片段pmylz2；所述Sleepy?Beauty轉座子骨架為PT2/BH。