[發(fā)明專利]耳聾單倍型基因突變無創(chuàng)檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202011338696.0
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112126677B
• 公開（公告）日: 2021-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 伍建;姬曉雯;王海麗;劉娜;韓路
• 申請（專利權(quán)）人: 北京邁基諾基因科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6827
• 分類號: C12Q1/6827;C12Q1/6883;G16B20/40;G16B25/20;G16B20/30;G16B20/50;G16B20/20
• 代理公司: 重慶博瑞泰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50256
• 代理人: 吳靜

本申請?zhí)峁┝艘栽袐D及其丈夫的白細(xì)胞的基因組DNA和孕婦的血漿游離DNA檢測胎兒耳聾單倍型基因突變的無創(chuàng)檢測方法，其中利用GemCode平臺將孕婦及其丈夫的基因組DNA制備二代測序文庫并將孕婦血漿游離DNA制備文庫；以特異性探針捕獲雜交；捕獲文庫通過二代測序平臺進(jìn)行高通量測序，得到測序原始數(shù)據(jù)；原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾、除去低質(zhì)量、接頭序列得到clean數(shù)據(jù)后，通過分析父母雙方的單倍型及胎兒遺傳信息，進(jìn)而確定胎兒的基因型。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請屬于分子生物學(xué)診斷領(lǐng)域，具體地，本申請?zhí)峁┝艘栽袐D及其丈夫的白細(xì)胞的基因組DNA和孕婦的血漿游離DNA檢測胎兒耳聾單倍型基因突變的無創(chuàng)檢測方法。

背景技術(shù)

聽力障礙是人類常見的出生缺陷之一，其發(fā)病率約0.1%-0.3%。在中國，攜帶耳聾基因突變的人群達(dá)到7000-8000萬，每年還新增6-8萬耳聾新生兒。

耳聾病因復(fù)雜，可以由單一基因突變或不同基因的復(fù)合突變引起，也可由環(huán)境因素（如醫(yī)療因素，環(huán)境暴露，創(chuàng)傷，藥物等）或基因和環(huán)境兩者共同作用而致。60%的耳聾是由耳聾基因突變導(dǎo)致的遺傳性耳聾，其中約70%變異來自于GJB2、SLC26A4、GJB3及線粒體DNA12SrRNA等4個熱點(diǎn)基因。大約21.01%的耳聾患者攜帶GJB2基因突變,是最常見的致聾因素，可導(dǎo)致先天性重度、極重度聾;SLC26A4基因突變是第二大致聾因素，可引起大前庭導(dǎo)水管綜合征性耳聾，其突變檢出率達(dá)12.7%；此外還有4.51%的耳聾患者攜帶線粒體12SrRNA基因突變，為藥物性耳聾患者常見致病變異。

耳聾遺傳方式多樣，有常染色體隱性、常染色體顯性、伴性遺傳等，臨床上以常染色體隱性遺傳多見。GJB2、SLC26A4大部分病例表現(xiàn)為隱性遺傳，即基因的純合或復(fù)雜合突變可能導(dǎo)致先天性耳聾或漸進(jìn)性耳聾，而單個雜合突變則為耳聾基因攜帶者。GJB2、SLC26A4攜帶者將來生育時如果配偶也為相同的 基因攜帶者，將有25%的概率造成后代先天性耳聾，有50%概率造成后代為耳聾基因攜帶者。因此，對孕前或孕期夫婦進(jìn)行耳聾基因變異篩查、對孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷可以提早得知生育患病兒的風(fēng)險，從根本上阻斷耳聾出生缺陷的發(fā)生，可以有效降低先天性耳聾患兒的出生，做到優(yōu)生優(yōu)育。

傳統(tǒng)的耳聾基因產(chǎn)前診斷主要通過羊膜腔穿刺術(shù)(簡稱羊穿)、絨毛穿刺術(shù)或臍帶血穿刺術(shù)等有創(chuàng)操作獲取胎兒細(xì)胞進(jìn)行檢測, 為侵入性產(chǎn)前診斷。侵入性產(chǎn)前診斷雖然準(zhǔn)確度高，但存在約1%的流產(chǎn)風(fēng)險。

1997年，Lo等在妊娠男性胎兒孕婦的外周血中檢測到Y(jié)染色體性別決定基因，證實(shí)孕婦外周血中存在cffDNA。cffDNA主要來源于胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞，以小片段DNA形式存在，cffDNA的濃度隨孕周的增加而增大，可達(dá)20%?；赾ffDNA這一特性的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測（NIPT）技術(shù)應(yīng)用而生，NIPT對于胎兒21/18/13三體的檢測，因其方法的高靈敏度、高準(zhǔn)確度已經(jīng)普遍用于臨床，并逐步向其他染色體異常檢測擴(kuò)展。目前絕大多數(shù)單基因病的無創(chuàng)檢測都需要依賴于先證者的樣本來構(gòu)建胎兒的單倍體型，從而判斷胎兒是否患有單基因遺傳病。這在極大程度上限制了無創(chuàng)單基因病檢測成為一種臨床篩查技術(shù)。

綜上所述，尋找一種非侵入性且準(zhǔn)確度高的產(chǎn)前檢測耳聾耳基因突變的方法是非常必要的。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，發(fā)明人嘗試避免取先癥兒樣本的步驟，僅使用孕婦及其丈夫的樣本來獲取胎兒基因型，建立了相應(yīng)檢測方法。

一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測耳聾基因突變的方法，其特征在于，所述方法步驟包括：

（1）從孕婦及其丈夫的白細(xì)胞中獲取基因組DNA，從孕婦血漿中獲取游離DNA；