[發(fā)明專利]一種用作支氣管敗血波氏菌病疫苗的重組蛋白及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011338163.2
• 申請(qǐng)日: 2020-11-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112375127B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱偉峰;譚凱;王芳;程序;仇汝龍;范志宇;陳露
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K14/235
• 分類號(hào): C07K14/235;C12N15/31;C12N15/70;A61K39/10;A61P31/04
• 代理公司: 北京德崇智捷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11467
• 代理人: 王繹涵

本發(fā)明屬免疫生物學(xué)領(lǐng)域,提供了一種截短表達(dá)的支氣管敗血波氏菌BcfA重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用,通過(guò)截短表達(dá)提高BcfA重組蛋白的表達(dá)量和可溶性。對(duì)BcfAN端373位氨基酸殘基之后的序列進(jìn)行了克隆和表達(dá)，截短后的BcfA的表達(dá)量提高了10倍，且主要為可溶性表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，截短表達(dá)后的BcfA依然與支氣管敗血波氏菌感染康復(fù)血清反應(yīng)明顯。免疫保護(hù)力實(shí)驗(yàn)表明BcfA的截短表達(dá)重組蛋白依然對(duì)支氣管波氏敗血波氏菌表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)作用。通過(guò)截短表達(dá)提高了BcfA重組蛋白的表達(dá)量和可溶性，為后期研制以BcfA重組蛋白抗原為基礎(chǔ)的基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬免疫生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種截短表達(dá)的支氣管敗血波氏菌BcfA重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

支氣管敗血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）是一種能感染多種哺乳動(dòng)物、引起動(dòng)物發(fā)生鼻炎和肺炎的革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。此菌以犬、豬及兔的感染最為普遍，常導(dǎo)致犬傳染性支氣管炎、豬傳染性萎縮性鼻炎和兔支氣管敗血波氏菌病。此外，支氣管敗血波氏菌和其他病原體之間存在協(xié)同作用，從而增加其他原發(fā)性和繼發(fā)性病原體引起的呼吸道疾病的嚴(yán)重程度，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。此外，也有報(bào)道支氣管敗血波氏菌感染人的報(bào)道。

目前已經(jīng)研制或有報(bào)道的支氣管敗血波氏菌病疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗三種。與滅活疫苗和減毒活疫苗相比，亞單位疫苗具有安全、穩(wěn)定和可以借助基因工程手段大量生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，正成為獸用疫苗研究的重要方向。支氣管敗血波氏菌的波氏菌克隆因子A（Bordetella colonization factor A， BcfA）蛋白是一種和細(xì)菌定殖有關(guān)的外膜蛋白，具有良好的免疫保護(hù)力，是支氣管敗血波氏菌亞單位疫苗研制的重要候選抗原。但是BcfA重組蛋白的表達(dá)量不高，而且主要以包涵體形式表達(dá)，這就不利于其臨床應(yīng)用。本研究的目的是通過(guò)對(duì)BcfA進(jìn)行截短表達(dá)，從而獲得一種表達(dá)量高、可溶性好、且較好地保留了原BcfA全長(zhǎng)蛋白免疫活性的重組蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是：通過(guò)對(duì)BcfA進(jìn)行截短表達(dá)，從而獲得一種表達(dá)量高、可溶性好、且較好地保留了原BcfA全長(zhǎng)蛋白免疫活性的重組蛋白，從而應(yīng)用于支氣管敗血波氏菌病疫苗的制備。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：提供一種用作一種用作支氣管敗血波氏菌病疫苗的重組蛋白，所述重組蛋白其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。

其中，編碼所述一種用作支氣管敗血波氏菌病疫苗的重組蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。

優(yōu)選的，所述重組蛋白可以添加His、GST標(biāo)簽，便于純化和鑒定。

所述用作支氣管敗血波氏菌病疫苗的重組蛋白的制備方法，其步驟如下所示:

(1)通過(guò)PCR擴(kuò)增BcfA的第373位到第968位氨基酸所對(duì)應(yīng)的DNA序列；

(2)將步驟(1)得到PCR產(chǎn)物連接到骨架質(zhì)粒上，得到表達(dá)載體；

(3)將步驟(2)得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主菌中誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)提取純化即得到重組蛋白。

優(yōu)選的，所述步驟（1）中PCR擴(kuò)增所采用的引物序列為：373T-F：cagcaaatgggtcgcggatccACGATCGCGCGCGTCGATAC和373T-R：gcaagcttgtcgacggagctcGTGAAGCAAGCCATCCACG，用于擴(kuò)增截短的BcfA。

優(yōu)選的，所述步驟（2）和（3）是通過(guò)包括下述步驟的方法實(shí)現(xiàn)的：將BcfA的PCR擴(kuò)增片段整合到骨架質(zhì)粒PET28a（+）上獲得表達(dá)載體，然后將整合成功的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入BL21宿主菌獲得重組菌，采用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，表達(dá)后用超聲波破碎儀器進(jìn)行破碎后，使用Ni磁珠純化BcfA重組蛋白。