[發明專利]一種試紙條及其制備方法與在轉基因蛋白AM79 EPSPS檢測中的應用

在審

• 申請號: 202011337772.6
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112526133A
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 樓億圓;何軍光;翁嘉慧;蔣紅葉;苗昱婷;王云鈴;趙振寧;周駿;費月新;陸建明
• 申請（專利權）人: 浙江新安化工集團股份有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/558;G01N33/543;G01N33/577;G01N33/58
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明涉及生物化學檢測技術領域，尤其涉及一種試紙條及其制備方法與在轉基因蛋白AM79 EPSPS檢測中的應用。本發明發明提供的轉基因蛋白AM79 EPSPS的手持式膠體金速測試紙可廣泛應用于轉基因蛋白AM79 EPSPS的快速檢測，該試紙具有以下特有優勢：(1)操作簡單，不需要專門的儀器設備，可方便的于田間等現場直接進行檢測。(2)檢測時間短(5～8min)；結果判定標準統一，即陰性結果(?)，只出現1條C線；陽性(+)：同時出現T線和C線。(3)經過驗證該試紙具有良好的靈敏性，最低檢測限可達0.1μg/mL。

技術領域

本發明涉及生物化學檢測技術領域，尤其涉及一種試紙條及其制備方法與在轉基因蛋白AM79 EPSPS檢測中的應用。

背景技術

利用宏基因組學方法從受草甘膦污染的土壤中分離得到的抗除草劑的EPSP合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase,EPSPS)是生物體內芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成過程中的關鍵性酶；草甘磷是通過抑制EPSP合成酶的活性而阻斷芳香族氨基酸的合成最終導致受試植物死亡。但是某些細菌的EPSP合成酶的活性不被草甘膦所抑制，所以細菌EPSPS基因的表達可以使植物免受除草劑的傷害。將除草劑抗性基因EPSPS轉入大豆，旨在培育具抗草甘膦優良特性的轉基因大豆，提高大豆生產中的田間除草效果，降低生產成本。

利用宏基因組學方法從受草甘膦污染的土壤中分離得到的抗除草劑的AM79EPSPS基因，構建了植物組成型表達載體pSOY19，由35S啟動子驅動，可以為轉基因植物提供草甘膦抗性。pSOY19質粒中只含有1種能在植物細胞中表達的基因：細菌EPSPS，位于CaMV35S啟動子的控制下。抗除草劑基因表達質粒為9557bp。插入序列AM79 EPSPS基因全長1341bp，編碼一個含有440個氨基酸的多肽。通過農桿菌介導法，已將EPSPS外源基因轉化大豆華春3號和Jack品種并獲得轉EPSPS基因的抗除草劑轉基因大豆材料。

此前，對AM79 EPSPS檢測多用常規的RT-PCR檢測方法，操作繁雜、耗時長、成本較高、且不能高通量檢測。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種試紙條及其制備方法與在轉基因蛋白AM79 EPSPS檢測中的應用，采用該試紙條可以快速可視化的實現對轉基因蛋白的AM79 EPSPS檢測。

本發明提供的試紙條，包括底板和依次設置在所述底板上的樣品墊、標記墊、硝酸纖維素膜、吸收墊；

所述金標墊擔載有膠體金標記的白蛋白抗體和膠體金標記的鼠抗AM79EPSPS單克隆抗體；

所述硝酸纖維素膜上設置有檢測區和控制區，所述檢測區包被有鼠抗AM79 EPSPS單克隆抗體；所述控制區包被有抗鼠IgG二抗；

所述鼠抗AM79 EPSPS單克隆抗體來自保藏編號為CCTCCNO:C201937的雜交瘤細胞株。

本發明中，所述金標墊上膠體金標記的鼠抗AM79 EPSPS單克隆抗體與所述硝酸纖維素膜上包被的鼠抗AM79 EPSPS單克隆抗體的質量比為1:20。

本發明中，所述樣本墊的大小為4mm×25mm；所述標記墊的大小為3mm×4mm；所述硝酸纖維素膜的大小為4mm×35mm；所述吸收墊的大小為4mm×30mm；

每個所述金標墊上膠體金標記的鼠抗AM79 EPSPS單克隆抗體的擔載量為40ng；每個所述硝酸纖維素膜上包被的鼠抗AM79 EPSPS單克隆抗體的質量為0.8μg。

本發明中，所述檢測區與控制區之間的間距為6～6.5mm。

本發明所述的試紙條的制備方法包括：

步驟1：在金標墊上固定膠體金標記的鼠抗AM79 EPSPS單克隆抗體，