[發(fā)明專利]基于TCR/BCR高通量測(cè)序的特定淋巴細(xì)胞含量分析方法及裝置

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202011336900.5
• 申請(qǐng)日: 2020-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN112322716B
• 公開（公告）日: 2021-07-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王謝;蘇政
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳泛因醫(yī)學(xué)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12M1/34;C12M1/00
• 代理公司: 廣州新諾專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬;劉杉

1.一種非診斷治療用途的基于TCR/BCR高通量測(cè)序的特定淋巴細(xì)胞含量分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)高通量測(cè)序：提取待測(cè)生物樣品的基因組DNA，獲得所提取的DNA的總質(zhì)量X，向其中投入預(yù)定量R條人工合成的TCR/BCR編碼基因內(nèi)標(biāo)序列，得加標(biāo)樣本，將此加標(biāo)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序；所述高通量測(cè)序步驟中，通過以下方法對(duì)加標(biāo)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序：

TCR/BCR基因片段富集：向提取的DNA中加入多重PCR擴(kuò)增引物，以及預(yù)定量R條人工合成的TCR/BCR編碼基因內(nèi)標(biāo)序列，對(duì)TCR/BCR基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，富集TCR/BCR基因片段；所述多重PCR擴(kuò)增引物序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.56所示；

文庫構(gòu)建：取上述反應(yīng)產(chǎn)物，構(gòu)建文庫；

高通量測(cè)序：對(duì)上述文庫進(jìn)行高通量測(cè)序；

所述多重PCR擴(kuò)增引物序列按照以下比例投入：

2)數(shù)據(jù)分析：獲取上述高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，分析得到的TCR/BCR基因序列，拆分得到內(nèi)標(biāo)序列數(shù)量Nr和待測(cè)樣本TCR/BCR基因序列數(shù)量Ns；根據(jù)投入的內(nèi)標(biāo)序列R與測(cè)序后檢出內(nèi)標(biāo)序列數(shù)量Nr，計(jì)算擴(kuò)增倍數(shù)Mn；將所述待測(cè)樣本TCR/BCR基因序列與目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因序列A進(jìn)行對(duì)比，得到與目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因序列A一致的原始抗原受體基因序列數(shù)量Na1、目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生測(cè)序錯(cuò)誤的序列數(shù)量Na2、目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生二次重排的序列數(shù)量Na3、目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生突變的序列數(shù)量Na4，以Na1、Na2、Na3和Na4的總和作為目標(biāo)淋巴序列總數(shù)Na；通過目標(biāo)淋巴序列總數(shù)Na和擴(kuò)增倍數(shù)Mn計(jì)算得到含有目標(biāo)淋巴細(xì)胞數(shù)量M，即得；

所述目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生測(cè)序錯(cuò)誤的序列通過以下方法確定：

通過序列比對(duì)，得到與序列A具有相同V和J基因的VJ一致序列，將上述VJ一致序列的CDR3區(qū)域與序列A進(jìn)行兩兩堿基比對(duì)，當(dāng)所述VJ一致序列CDR3區(qū)域與序列A的差異堿基數(shù)小于等于差異閾值，且不一致的堿基測(cè)序質(zhì)量值小于等于測(cè)序質(zhì)量閾值，則將該VJ一致序列判定為目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生測(cè)序錯(cuò)誤的序列，數(shù)量計(jì)為Na2；

所述目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生二次重排的序列通過以下方法確定：

通過序列比對(duì)，得到與序列A具有相同J基因的J一致序列，確定此J一致序列的CDR3區(qū)域的V基因部分和非V基因部分，分析該J一致序列上CDR3區(qū)非V基因序列與序列A上CDR3區(qū)非V基因序列的一致性，當(dāng)該J一致序列的非V基因部分序列與序列A的非V基因序列一致，且該J一致序列的V基因是序列A的V基因的上游基因片段，則將該J一致序列判定為目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生二次重排的序列，數(shù)量計(jì)為Na3；

所述目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生突變的序列通過以下方法確定：

通過序列比對(duì)，得到與序列A具有相同V基因、J基因且CDR3長度一致的TCR/BCR基因序列，將其與序列A上的CDR3序列進(jìn)行兩兩比對(duì)，選取與序列A上的CDR3序列相似度超過預(yù)定閾值的序列集，將此序列集中各序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹；并且將此序列集中的序列與序列A的V，D，J基因序列比對(duì)，確定每條序列的突變位點(diǎn)，將突變率最少的序列作為進(jìn)化樹的根，確定序列A在進(jìn)化樹上的位置，進(jìn)化樹中序列A之后的進(jìn)化分支的序列即為目標(biāo)淋巴細(xì)胞抗原受體基因發(fā)生突變的序列，數(shù)量計(jì)為Na4；

所述含有目標(biāo)淋巴細(xì)胞數(shù)量M通過以下公式計(jì)算得到：M＝Na/Mn。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非診斷治療用途的基于TCR/BCR高通量測(cè)序的特定淋巴細(xì)胞含量分析方法，其特征在于，以所提取的DNA的總質(zhì)量X除以單個(gè)細(xì)胞的基因組平均重量，得到樣品總細(xì)胞數(shù)N，待測(cè)生物樣本中目標(biāo)淋巴細(xì)胞的相對(duì)含量y通過以下公式計(jì)算得到：y＝M/N×100％。

3.一種基于TCR/BCR高通量測(cè)序的用于檢測(cè)淋巴造血細(xì)胞腫瘤微小殘留含量的檢測(cè)試劑盒，包括：

內(nèi)標(biāo)序列：人工合成TCR/BCR的編碼基因內(nèi)標(biāo)序列；

多重PCR擴(kuò)增引物：如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.56所示TCR/BCR基因擴(kuò)增引物；所述多重PCR擴(kuò)增引物的使用比例如下：

4.一種基于TCR/BCR高通量測(cè)序的用于檢測(cè)淋巴造血細(xì)胞腫瘤微小殘留含量的檢測(cè)裝置，包括：

高通量測(cè)序模塊：包括權(quán)利要求3所述試劑盒中的多重PCR擴(kuò)增引物，該高通量測(cè)序模塊用于提取待測(cè)生物樣品的基因組DNA，獲得所提取的DNA的總質(zhì)量X，向其中投入預(yù)定量R條人工合成的TCR/BCR編碼基因內(nèi)標(biāo)序列，得加標(biāo)樣本，將此加標(biāo)樣本按照權(quán)利要求1所述的方法進(jìn)行高通量測(cè)序；

數(shù)據(jù)分析模塊：用于獲取上述高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)分析模塊包括含有按照權(quán)利要求1的方法所述邏輯計(jì)算的介質(zhì)，計(jì)算得到含有目標(biāo)淋巴細(xì)胞數(shù)量M，所述目標(biāo)淋巴為淋巴造血細(xì)胞腫瘤微小殘留細(xì)胞。