[發明專利]一種重組蛋白INP-AidH及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202011335679.1
• 申請日: 2020-11-25
• 公開（公告）號: CN112481236B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 謝浩;蔣嘉峰;賀盼盼;郭君慧;王琳;顏禮娜
• 申請（專利權）人: 武漢理工大學
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C07K19/00;C12N15/70;C12N11/14;C12R1/19
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 張秋燕

1.一種重組蛋白INP-AidH的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（a）設計引物擴增AidH片段，引入BamH?I?和Xho?I酶切位點，得到擴增后的AidH片段；

（b）用BamH?I?和Xho?I分別對載體和步驟（a）所得擴增后的AidH片段進行雙酶切，再通過消化、純化后，分別得到載體產物和AidH片段產物；將載體產物和AidH片段產物連接，構建得到重組質粒pET-28a-INP-AidH；

（c）含重組質粒?pET-28a-INP-AidH的工程菌經IPTG誘導表達后提取、洗滌獲得存在于細胞膜碎片上的重組蛋白INP-AidH；

步驟（a）具體為：以質粒pET-28a-AidH為模版，AidH?BamH?I?F1和AidH?Xho?I?R1為引物PCR擴增，得到擴增后的AidH片段；其中，所述引物AidH?BamH?I?F1為5’-GTTAAAGGATCCATGACCATCAACTACCACGAAC-3’，AidH?Xho?I?R1為5’-GTGGTGCTCGAGGCCACCTCCGCCTTCGAGCTGGGTGCAGTC-3’；

步驟（b）所述載體為質粒pET-28a-INP-MagR；

步驟（c）中具體過程為：將重組質粒pET-28a(+)-INP-AidH轉化入大腸桿菌工程菌，挑選陽性的菌落接種于3ml?LB培養基過夜培養，過夜菌液按1：50接種于LB培養基擴大培養至OD₆₀₀為0.5后加入IPTG終濃度為0.2mmol/L，于37℃培養6h或20℃培養16h，后5000g?4℃離心10min，所得菌沉淀加入10ml/g裂解液高壓破碎細胞，細胞破碎液5000g?4℃下離心10min分離上清液；所述上清液120000g?4℃下離心1h收集沉淀，該沉淀經PBS洗滌，即獲得位于細胞膜碎片上的重組蛋白INP-AidH。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述擴增條件為：第一階段：95℃預變性5分鐘；第二階段：95℃變性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，10個循環；第三階段：95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分鐘，10個循環；第四階段：72℃延伸3分鐘。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（b）的雙酶切體系為：31μl?ddH₂O加2μl酶加5μl?buffer與10μl底物37℃孵育4h，底物分別為載體或步驟（a）所得擴增后的AidH片段。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（b）消化過程分別為：向雙酶切后的載體體系加入8μl?Fast?AP?buffer?與?2μl?Fast?AP；向雙酶切后的AidH片段體系加入1μl?DpnI?buffer?與?1μl?Dpn?I，37℃消化1h。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（b）連接過程為：將純化后載體與AidH片段按摩爾比1：3進行混合后添加T4連接酶，于16℃下連接16h，獲得重組質粒pET-28a-INP-AidH。