[發明專利]一種具有啟動子功能的落葉松DNA分子、獲取及鑒定方法

有效

• 申請號: 202011332979.4
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112481260B
• 公開（公告）日: 2022-06-14
• 發明（設計）人: 劉鵬;張韜;劉冠卿
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;G01N21/64
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種具有啟動子功能的落葉松DNA分子，DNA序列如SEQ ID NO.1。

2.權利要求1所述的具有啟動子功能的落葉松DNA分子的獲取方法，其特征在于：包括如下步驟：用特異引物以日本落葉松(Larix kaempferi)的基因組DNA為模板，擴增得到1179bp的擴增產物，即得具有啟動子功能的落葉松DNA分子。

3.根據權利要求2所述的具有啟動子功能的落葉松DNA分子的獲取方法，其特征在于：所述特異引物序列如下：

正向：5’-gagtgtcgtgctccaccatgcaatgagacttcaaaccggc-3’；

反向：5’-ctcttcttcttaggagccatgtaccaaaatttgaagggcgg-3’。

4.權利要求1所述的具有啟動子功能的落葉松DNA分子的獲取方法，其特征在于：落葉松RNA-seq：將落葉松針葉和落葉松愈傷組織分別進行轉錄組測序，對轉錄本進行注釋；ATAC-seq：將誘導培養的落葉松愈傷組織進行ATAC-seq測序，確定開放染色質信息；組蛋白ChIP-seq：將誘導培養的落葉松愈傷組織進行H3K27ac ChIP-seq測序，明確H3K27ac的分布特征，整合組學分析結果，預測潛在調控元件，綜合測序數據，通過拼裝獲得落葉松序列SEQID NO.2，該序列中包括一個轉錄本，啟動子位于基因的轉錄起始位點(TSS)上游，并且位于開放染色質區，能調控下游基因的表達，將其轉錄本TSS上游1.5kb具有開放染色質的序列擴增，最終獲得SEQ ID NO.1。

5.權利要求1所述的具有啟動子功能的落葉松DNA分子的鑒定方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)將啟動子DNA序列SEQ ID NO.1插入P1300LV載體中替換原有的CaMV35S啟動子，構建LkPro2啟動報告基因的載體；

(2)正對照載體采用P1300LV；

(3)落葉松原生質體的制備與轉化；

(4)轉化后對啟動子活性進行熒光驗證。

6.根據權利要求5所述的具有啟動子功能的落葉松DNA分子的鑒定方法，其特征在于：所述LkPro2啟動報告基因的載體的構建方法：使用限制性內切酶NcoI和BamHI將P1300LV載體線性化，后用無縫連接試劑盒將其與啟動子序列片段連接，轉化至大腸桿菌DH5α中，篩選陽性轉化子，即得。