[發明專利]基于CRISPR/Cas9基因編輯系統敲除豬miR-155基因的細胞系及構建方法

在審

• 申請號: 202011331839.5
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112481218A
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 李聰聰;謝勝松;李婉濤;張永輝;張慧慧;趙婉霞;石珍珍;劉思雨;劉海龍;姜東鳳;韓浩園;牛暉
• 申請（專利權）人: 河南牧業經濟學院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/113;C12N15/85
• 代理公司: 河南豫龍律師事務所 41177
• 代理人: 游國戰

本發明提供一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統的敲除豬miR?155基因的細胞系及其構建方法，涉及基因工程技術領域，本發明公開了一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統的敲除豬miR?155基因的細胞系及其構建方法，該細胞系采用以下步驟制備：根據豬miR?155基因的前體序列及成熟體序列設計優選sgRNA向導序列；將sgRNA39 F和sgRNA39 R序列退火形成雙鏈DNA，將DNA與線性化pKLV2?U6gRNA5(gGFP)?PGKBFP2AGFP?W載體連接獲得重組質粒，與慢病毒包裝質粒PSPXA2、PMD2.G穩定轉染HEK293T細胞包裝成慢病毒；收集濃縮病毒感染穩定表達Cas9蛋白的豬肺泡巨噬細胞系（3D4/21），通過無限稀釋或流式分選的方法挑取單克隆細胞，擴大培養成細胞系，建立豬miR?155基因敲除的細胞系，為進一步進行抗病候選基因miR?155的功能研究提供有效的細胞研究模型。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種基于CRISPRCas9基因編輯系統的敲除豬miR-155基因的細胞系及構建方法。

背景技術

CRISPR/Cas系統是由RNA介導的對DNA修飾的基因編輯工具，該技術可以對基因組特定位點進行缺失、插入、修復等靶向編輯，是目前基因組編輯領域最受歡迎的新技術。CRISPR/Cas系統是人們在古細菌和細菌中發現的一種獲得性免疫機制。CRISPR/Cas系統有三種類型：TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ，其中僅存在于細菌的TypeⅡ系統只需要一個Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，由于其簡易性和可操作性，TypeⅡ系統已被改造為最成功的人工核酸酶，是最有力的基因編輯工具，成為基因編輯領域最炙手可熱的技術。

存在機體組織微環境中的巨噬細胞是重要的免疫細胞，具有吞噬、抗原加工與遞呈、免疫調節等生理功能，在機體先天性免疫和獲得性免疫中發揮重要作用。豬體受到細菌（豬沙門氏菌、副豬嗜血桿菌）或病毒（豬藍耳?。└腥竞?，常常首當其沖受到影響的是巨噬細胞，比如肺泡巨噬細胞。大量研究數據表明細菌（比如副豬嗜血桿菌）感染削弱巨噬細胞的免疫力導致豬對細菌易感，病毒（豬藍耳?。└腥疽种凭奘杉毎墓δ苄纬蓢乐孛庖咭种茖е仑i體對其它病毒性疾病和細菌性疾病易感性明顯增加。

miR-155基因是重要的抗病候選基因。miR-155促進機體免疫細胞分化，調控機體炎癥反應和免疫應答，在機體抵抗感染中發揮重要作用。目前尚未有關于豬miR-155基因的敲除載體及豬miR-155基因敲除的豬肺泡巨噬細胞系（3D4/21細胞系）模型的相關報道。

發明內容

（一）解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統特異性靶向敲除豬miR-155基因的細胞系及其構建方法，本發明為進一步對抗病候選基因miR-155的功能研究提供有效的細胞研究模型。

（二）技術方案

為實現以上目的，本發明通過以下技術方案予以實現：

本發明首先提供一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統特異性靶向敲除豬miR-155基因的優選sgRNA向導序列，即sgRNA39，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

本發明還提供了一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統特異性靶向敲除豬miR-155基因的細胞系，所述細胞系為豬肺泡巨噬細胞系。

本發明還提供一種基于CRISPR/Cas9基因編輯系統特異性靶向敲除豬miR-155基因的細胞系的構建方法，所述構建方法包括以下步驟：

（1）設計并合成豬miR-155基因特異性sgRNA向導序列，即sgRNA39，其序列如SEQID NO:1所示；

（2）構建miR-155基因敲除載體，pKLV2-U6-gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W-sgRNA39；

（3）將步驟（2）中所述的敲除載體與慢病毒包裝質粒PSPXA2、PMD2.G，然后穩定轉染HEK293T細胞，得到包裝慢病毒，并將其濃縮；