[發明專利]兩種甘薯U6基因啟動子IbU6的克隆與應用

有效

• 申請號: 202011328994.1
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112481259B
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 朱友林;王東;楊松濤;賀熱情;蔣麗蕓
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/82;C12N15/64;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 袁紅梅

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及兩種甘薯RNA聚合酶III型啟動子，更具體涉及兩種甘薯U6基因啟動子IbU6.1與IbU6.3，并進一步公開其克隆方法與應用。本發明在甘薯中克隆獲得兩種甘薯RNA聚合酶III型啟動子???甘薯內源U6啟動子IbU6.1與IbU6.3，它們屬于甘薯內源RNA聚合酶III型啟動子，具有高效轉錄活性，可驅動下游sgRNA的表達，并通過甘薯穩定轉化體系分別驗證了這兩種啟動子的活性及其應用于甘薯CRISPR/Cas9基因編輯系統的可行性，并實現了CRISPR/Cas9介導的甘薯基因組靶向編輯。

技術領域

本發明屬生物技術領域，特別是植物轉基因技術領域，具體涉及甘薯U6啟動子的克隆和應用。

背景技術

甘薯是世界上第7大糧食作物，中國是甘薯最大的種植生產和消費國(FAO，2014)。甘薯屬于六倍體(2x＝6n＝90)，染色體小、倍型高。遺傳組成的復雜性使甘薯遺傳研究難度遠大于水稻、玉米等作物。此外，廣泛存在于甘薯種內、種間的雜交不親和性嚴重限制了甘薯雜交育種中親本的自由選配及優異基因在育種中的利用，成為限制甘薯育種發展的瓶頸(Liu Q.,2017)。甘薯新材料的創制和新品種的選育主要是以傳統雜交育種為主，選育時間長、效率低、產量品質抗性等主要性狀很難兼顧,因此迫切需要高效的技術手段對甘薯進行遺傳改良。

CRISPR(cluIbered regulatory interspaced short palindromic repeats)是廣泛存在于細菌和古細菌里基于核酸的適應性免疫系統，它被用來抵抗病毒和質粒的侵入(Wiedenheft et al.,2012)。CRISPR-Cas9屬于二型的CRISPR系統，核酸內切酶Cas9與二個非編碼RNAs,CRISPR RNA(crRNA)、trans-acting crRNA(tracrRNA)形成復合物通過序列匹配在特定的DNA區域造成雙鏈斷裂。作為一種高效的遺傳改良工具，現在CRISPR-Cas9被廣泛用來在不同植物進行基因編輯產生可遺傳的突變，如擬南芥、水稻、大豆，包括甘薯及其近緣物種日本牽牛等(Feng et al.,2013；Shan et al.,2013；Li et al.,2015；WatanabeK et al.；2017Wang et al.,2019)。因此驗證Cas9在甘薯基因組上的作用不僅有助于增加甘薯基因功能研究的手段，而且也為將來甘薯的分子育種提供新的工具。

目前，U6 RNA是一種參與mRNA前體剪接的非編碼RNA，其對應的U6啟動子是一類RNA聚合酶III型啟動子，已經在許多物種的CRISPR/Cas9系統中得到了大量的應用。在轉基因技術領域，U6啟動子多用在構建RNAi表達載體上，用于啟動干擾發夾結構的表達；此外，隨著基因編輯技術的興起，U6啟動子也被開始廣泛用于CRISPR系統中sgRNA引導序列的啟動表達，以保證引導序列的結構特征。U6啟動子具有種屬特異性，在轉基因技術中，使用轉化物種本身或接近物種的U6啟動子能取得更高的啟動效率。雖然在許多物種中U6啟動子已有大量的報道，但外源的U6啟動子通常并不適用。可見，缺少適用的內源U6啟動子已成為目前甘薯CRISPR/Cas9基因編輯體系的限制因子，也限制了CRISPR/Cas9基因組編輯技術在甘薯育種中的應用。因此，篩選出在甘薯中有功能活性的U6啟動子對于甘薯的基因育種技術發展具有積極的意義。

發明內容

為此，本發明所要解決的技術問題在于提供兩種甘薯U6基因啟動子IbU6.1與IbU6.3，并進一步公開其克隆方法及應用。

為解決上述技術問題，本發明所述的兩種甘薯U6基因啟動子IbU6.1與IbU6.3，所述啟動子IbU6.1包括如SEQ ID No：1所示的DNA核苷酸序列，啟動子IbU6.3包括如SEQ IDNo：2所示的DNA核苷酸序列。

上述甘薯U6基因啟動子IbU6.1與IbU6.3都屬于甘薯U6 snRNA基因的RNA聚合酶III型啟動子，來源于甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)。