[發明專利]一種乳狀液膜法純化水蛭素方法

有效

• 申請號: 202011328312.7
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112321703B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 王炯;程世娟;周萬輝;曾英姿;王冬梅;趙磊
• 申請（專利權）人: 山東沃華醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/815
• 分類號: C07K14/815;C07K1/14
• 代理公司: 北京華科聯合專利事務所(普通合伙) 11130
• 代理人: 王為

本發明涉及一種乳狀液膜法純化水蛭素方法，所述方法，包括以下步驟：1)水蛭用水煎煮1?3次，每次1?3小時，合并煎液，濃縮加入乙醇至含醇量為80?90％，靜置，離心，取上清液調節pH＝4?6，備用；2)大豆油，表面活性劑，液體石蠟混合，取此混合物加入NaOH水溶液，攪拌即制得穩定的乳狀液；3)將步驟1)得到的備用液與步驟2)得到的乳狀液混合攪拌提取，靜置分層，分離出乳液，水浴加熱乳液進行破乳，靜置后分離得到的水層，即為水蛭素溶液。

技術領域：

本發明涉及一種水蛭素純化方法，特別涉及一種采用乳狀液膜法純化水蛭素工藝。

背景技術：

水蛭素(Hirudin)是水蛭(Leech)及其唾液腺中提取出的一種成分，水蛭素對凝血酶有極強的抑制作用，是迄今為止所發現最強的凝血酶天然特異抑制劑。天然水蛭素是由65或66個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子量約為7000，能在極端的pH和熱條件下穩定存在。

水蛭素通常以丙酮、乙醇和水處理原料得到粗提取物，再用液相色譜或等電聚焦進行純化，如：1985年Markwardt等采用離子交換與親合色譜相結合的方法從日本醫蛭鮮體中獲得了高純度的水蛭素。1990年Steiner等運用凝膠色譜、離子色譜、反相色譜進行純化，采用高效液相色譜毛細管區帶電泳和等離子飛行時間質譜進行鑒定，分離得到兩種水蛭素亞型P6和P18，抗凝活性與HV1相似。1992年，Emanuela利用離子色譜、親和色譜和反相色譜三者相結合，從菲牛蛭頭部中提取得到2種水蛭素(Hm1和Hm2)。

使用凝膠色譜，離子交換色譜，反相液相色譜、親和色譜，多維液相色譜等也有報道，這些方法各有優缺點，分別適合不同分子量的產物。現有色譜法存在以下缺點，制約水蛭素純化。

一是需要采用峰容量更大，純化度更高的多維液相色譜技術對水蛭素進行分離純化，設備要求高，成本高。

二是特異選擇性較差，純化后所得產物的蛋白含量和抗凝活性較低，含有大量雜蛋白及小分子雜質組分。

三是分離純化中被廣泛應用的大孔吸附樹脂在生產和使用過程中往往存在正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯等有毒物質殘留,可能造成純化產物的污染。

水蛭中含有大量的偽水蛭素組分，結構上與水蛭素類似，要得到更高純度的水蛭素，需要有針對性地設計提取及純化方法。

乳狀液膜分離技術是通過兩液相間形成的界面液相膜,將2種組成不同但又互相混溶的溶液隔開,經選擇性滲透,將物質分離提純的方法。乳狀液膜的分離過程是將含有表面活性劑和膜溶劑的油相和水相(內水相)置于容器中,在高速攪拌下制成油包水型乳狀液,再將此乳狀液分散到另一種水溶液(第3相)中,就得到了水包油再油包水型(W/O/W)乳狀液膜。乳狀液膜體系包括膜相(液膜)、回收相(內相)和連續相(外相)3個部分。當乳狀液分散到第3相時,形成許多直徑為0105～0120cm的乳珠。在乳珠與第3相間有巨大的接觸面積,同時每個乳珠內部又包含無數個直徑非常小的內水相微滴,分隔水相的有機液膜最薄可以達到1～10μm。這樣具有巨大的接觸面積和很薄的液膜,決定了分散體系有很快的傳質速度,具有高效快速的優點。另外,由于內水相的作用,它的分離富集作用不受平衡的影響,打破了萃取過程的平衡,而且把萃取和反萃取合二為一,因此在分離富集那些含量比較低的物質時,更是具有萃取分離所無法比擬的優越性。通常內相和連續相是互溶的,膜相則以膜溶劑為基本成分。為了維持乳狀液一定的穩定性及選擇性,往往在膜相中加入表面活性劑和添加劑。

《中國中藥雜志》2012年20期公開了一種以D2EHPA為流動載體的乳狀液膜萃取菲牛蛭中的水蛭素的方法，該方法以菲牛蛭為原料,二-(2-乙基已基)磷酸(D2EHPA)作流動載體,脫水山梨醇脂肪酸酯(Span 80)為乳化劑,辛烷與D2EHPA混合構成膜溶液,稀HCl溶液作內水相的水蛭素乳狀液膜體系萃取。得到的結論是:乳狀液膜體系萃取水蛭素工藝較簡單,實驗樣品純度及ATU回收率均較高。

但該方法具有以下缺點：