[發明專利]一種巨噬細胞中幽門螺絲桿菌的標記方法

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• 申請號: 202011326803.8
• 申請日: 2020-11-24
• 公開（公告）號: CN112322693A
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 朱君;徐艷;楊迪誠;黃鋼
• 申請（專利權）人: 上海健康醫學院
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C01B32/15;C12R1/01
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 王穎

本發明提出了一種巨噬細胞中幽門螺絲桿菌的標記方法。主要通過合成具有靶向和顯色作用的碳納米球，靶向標記幽門螺絲桿菌，實現幽門螺絲桿菌的可視化標記，然后將標記的幽門螺絲桿菌轉染至巨噬細胞中，實現巨噬細胞中幽門螺絲桿菌的標記。其中，甘露糖能靶向巨噬細胞，適配體能靶向幽門螺絲桿菌，染色劑能顯色。本發明的優點在于：(1)本發明以生物質碳源為原料制備碳納米球。所用原料生物安全性高、毒性小，碳納米球表面具有豐富的含氧基團，易于進一步功能化。(2)本發明中甘露糖能靶向巨噬細胞，適配體能靶向幽門螺絲桿菌，染色劑能顯色，實現了多功能的作用。

技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體涉及一種細菌的標記方法，該細菌能被巨噬細胞吞噬，從而實現巨噬細胞中細菌的標記。

背景技術

巨噬細胞屬于免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞Macrophages是一種位于組織內的白血球，源自單核細胞，而單核細胞又來源于骨髓中的前體細胞。巨噬細胞和單核細胞皆為吞噬細胞，在脊椎動物體內參與非特異性防衛(先天性免疫)和特異性防衛(細胞免疫)。它們的主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片或病原體進行噬菌作用(即吞噬以及消化)，并激活淋巴球或其他免疫細胞，令其對病原體作出反應。

細胞熒光標記在細胞生物學、生物醫學等領域得到廣泛使用，如流式細胞儀、激光掃描共聚焦顯微鏡等廣譜分析等。新型、簡潔的細菌(特別是致病菌)的熒光標記對細菌病理學與免疫學的研究提供了極大的便利。而傳統的細菌熒光標記使用表達綠色熒光蛋白表達細菌。該方法需要對細菌進行DNA轉染，蛋白表達等技術手段處理。另外，研究者采用D-氨基酸綴合熒光素與細菌在生長溶液中孵育，該探針被細菌吸收，通過細胞代謝途徑，共價鍵連接在細菌的細胞壁。該方法能夠熒光標記含有不同細菌，包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌；標識細菌細胞壁，不改變細菌外膜結構，便于研究細菌表面成分的生物學功能；可以實現活細菌的標記。但是如何實現活細胞中細菌的標記仍是研究的熱點。

發明內容

為了解決現有技術中存在的上述問題，本發明提出了一種巨噬細胞中幽門螺絲桿菌的標記方法。主要通過合成具有靶向和顯色作用的碳納米球，靶向標記幽門螺絲桿菌，實現幽門螺絲桿菌的可視化標記，然后將標記的幽門螺絲桿菌轉染至巨噬細胞中，實現巨噬細胞中幽門螺絲桿菌的標記。其中，甘露糖能靶向巨噬細胞，適配體能靶向幽門螺絲桿菌，染色劑能顯色。

為了實現這樣的目的，在本發明的技術方案中，首先通過合成具有靶向和顯色作用的碳納米球，靶向標記幽門螺絲桿菌，實現幽門螺絲桿菌的可視化標記，然后將標記的幽門螺絲桿菌轉染至巨噬細胞中。

本發明的方法包括如下步驟：

1、碳納米球的制備

配制濃度為10-20份的檸檬酸100份去離子中，充分攪拌后轉入帶有聚四氟乙烯內膽的高壓反應釜，在120-200℃條件下，反應時間24小時，反應結束后，反應釜自然冷卻到約60℃，用乙醇和去離子水依次洗滌數次，離心分離，真空烘干，得到碳納米球。

2、碳納米球的表面修飾

將10-20份的氨基修飾的甘露糖與20-40份的碳納米球超聲分散于100份去離子水中，再分別加入5-10份的染色劑和適配體，在攪拌條件下，緩慢加入與碳納米球質量比為1：1的偶聯劑，室溫下反應24小時，反應后溶液經離心、沉淀、洗滌，干燥后，得到表面修飾的碳納米球。

3、細菌的靶向定位與巨噬細胞的轉染

將制備的表面修飾的碳納米球與幽門螺絲桿菌共培養24小時后，洗去未吸附的碳納米球。再將吸附碳納米球的幽門螺絲桿菌轉染至巨噬細胞中，通過熒光顯微鏡觀察細菌在細胞中的狀態。

上述的偶聯劑可以為：1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，其中EDC和NHS的質量比為1:1。