[發明專利]一種基因編輯的方法

在審

• 申請號: 202011326638.6
• 申請日: 2020-11-23
• 公開（公告）號: CN114525304A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 牛冬;汪滔;曾為俊;馬翔;王磊;程銳;黃彩云
• 申請（專利權）人: 南京啟真基因工程有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/55;C12N15/113
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 徐丹丹;張丹

1.一種基因編輯的方法，其特征在于，所述的方法包括將包含外源基因的安全港位點載體、sgRNA載體和Cas載體共轉染至宿主細胞，其中，所述的Cas載體包含編碼Cas蛋白、EGFP和Puro蛋白的核苷酸序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Cas載體還包含EF1a啟動子、WPRE元件和3’LTR序列元件，優選的，所述的Cas載體的核苷酸序列從5’-3’依次為：CMV增強子、EF1a啟動子、核定位信號、核定位信號、編碼Cas蛋白的核苷酸序列、核定位信號，核定位信號、編碼自剪切多肽P2A的核苷酸序列、編碼EGFP的核苷酸序列、編碼自裂解多肽T2A的核苷酸序列、編碼Puro蛋白的核苷酸序列、WPRE序列元件、3’LTR序列元件和polyA信號序列元件，其中，所述的Cas蛋白選自Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5d、Cas5t,Cas5h,Cas5a、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csy4、Csel、Cse2、Cse3、Cse4、Cse5e、Cscl、Csc2、Csa5、Csnl、Csn2、Csml、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、CsxlO、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、CsxlS、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Csdl、Csd2、Cstl、Cst2、Cshl、Csh2、Csal、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5、C2cl、C2c2、C2c3、Cpfl、CARF、DinG、其同源物或其修飾形式，優選為Cas9。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的Cas載體的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述的方法包括將包含外源基因的安全港位點載體、sgRNA載體和Cas載體共轉染至宿主細胞中，使安全港位點載體上的外源基因分別整合入ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1任一個或兩個以上安全港位點，優選的，ROSA26安全港位點區域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，AAVS1安全港位點區域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，H11安全港位點區域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，COL1A1安全港位點區域及其上下游各500bp的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。

5.根據權利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA載體包含靶向ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位點的sgRNA，其中，

靶向ROSA26的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：45-48任一所示，靶向AAVS1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：49-52任一所示，靶向H11的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：53-56任一所示，靶向COL1A1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：57-60任一所示。

6.根據權利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的安全港位點載體包含與ROSA26、AAVS1、H11或COL1A1安全港位點5’端同源的5’同源臂和/或3’端同源的3’同源臂，優選的，還包含絕緣子區域、EF-1α啟動子，編碼EGFP蛋白的核苷酸序列，EF-1αpoly(A)信號序列,PGK啟動子，編碼mCherry蛋白的核苷酸序列，bGH poly(A)信號序列，loxP-puro-loxP表達框區域，pCAG啟動子，和/或β-globin poly(A)信號序列，進一步優選的，ROSA26安全港位點載體如SEQ ID NO：4所示，AAVS1安全港位點載體如SEQ ID NO：5所示，H11安全港位點載體如SEQ ID NO：6所示，COL1A1安全港位點載體如SEQ ID NO：7所示；

優選的，所述的外源基因的核苷酸序列位于安全港位點5’同源臂與3’同源臂之間。